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大规模单细胞RNA测序基准测试分析

已有 291 次阅读 2026-10-31 15:56 |个人分类:科普|系统分类:科普集锦

大规模单细胞RNA测序基准测试分析

随着单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 进入青少年时期，我们目睹了实验和数据集的规模和复杂性迅速增加。事实上，早期的 scRNA-seq 包含数百到数千个细胞，通常处于单一条件下，并且通常没有生物复制，而当代实验则包括在不同条件（例如治疗、基因型、健康状态）下测量的多个个体的细胞。通常，研究人员每次重复的目标是5 - 10,000 个细胞，最终数据集很容易包含数十万个细胞。此外，单细胞图谱已经变得成熟，并且由于编程访问，现在可以直接下载和本地分析由来自不同实验室的多个器官的数百万个细胞组成的数据集。

这种日益增加的复杂性给整个分析流程（从数据预处理到下游解释）带来了巨大的计算挑战。许多 scRNA-seq 分析的探索性性质加剧了这些挑战，这些分析需要以交互方式处理大型数据集，例如尝试不同的分析路径并探索下游结果，通常使用台式机或笔记本电脑而不是高性能计算 (HPC)，需要节俭且高效的工作流程。

典型的 scRNA-seq 分析工作流程从基因表达定量开始，该过程包括将读数分配给条形码、将读数与适当的基因组或转录组对齐，以及通过计算分配给每个基因的唯一分子标识符 (UMI) 来量化基因表达。此过程通常在 HPC 集群中执行，并且通常使用独立软件或标准化管道来执行。此步骤通常不是上述交互过程的一部分。

预处理后，分析工作流程包括以下步骤（图1a）：（i）质量控制； (ii) 基因和细胞过滤； (三) 标准化； (iv) 高度可变基因的鉴定； (v) 降维，通常使用主成分分析（PCA）或类似方法； (vi) 数据可视化，使用 t-SNE 和 UMAP 等方法，这些方法通常应用于通过 PCA 减少数据； (vii) 聚类以识别具有相似转录谱的细胞群； (viii) 细胞类型注释，即使用外部参考数据集或已知标记基因的表达来标记细胞或簇的过程。每个步骤都需要自己的处理时间和内存使用量，并且在过去几年中，已经用不同的编程语言（主要是 R 和 Python）提出了几种方法。

虽然文献中已经尝试对各个分析步骤进行基准测试，例如归一化、降维、聚类、轨迹推断、细胞类型注释、数据集成，但整个分析工作流程的比较却很少受到关注。以往研究探讨了 Seurat 和 Scanpy 中参数选择及其默认值的影响，但没有彻底检查它们的可扩展性。另一方面，已有研究虽然对典型分析的所有不同步骤进行了基准测试，但没有考虑最流行框架通常推荐的工作流程。此外，用于基准测试的数据集相对较小，不足以解决可扩展性问题。

在这里，Billato等人关注三个最流行的分析框架，即 Bioconductor、scverse/Scanpy 和 Seurat（图 1b）。对于 Bioconductor，考虑标准的编排单细胞分析 (OSCA) 工作流程和 scrapper，这是一种更新的高效实现，可将大部分计算卸载到 C++。为了比较这些工作流程，依靠它们各自的文档，特意选择“快速入门”或“基础”教程，其中包含分析中始终存在的步骤。基准测试中不包含更先进的方法，例如多样本集成、批量效应减少、基于参考的注释。

虽然传统方法依赖于 CPU 架构，但通常允许多线程和并行计算，但最近的努力已经探索使用 GPU 来提高速度和可扩展性。因此，在基准测试中加入了rapids singlecell框架，这是一个利用NVIDIA GPU实现标准单细胞分析工作流程的开源库（图1b）。在这种情况下，基准测试工具和工作流程对于评估不同实验设置（例如细胞数量、测序深度或生物复杂性）中不同方法的性能至关重要，不仅在效率方面，而且确保可扩展性不会以降低准确性为代价。

本文的目标有三个：首先，目标是对上述五个 scRNA-seq 工作流程进行基准测试，即 Seurat、OSCA、scrapper、Scanpy 和 Rapids singlecell。其次，通过将 PCA 作为示例分析步骤，更详细地探讨不同的算法和输入选择如何影响方法的效率和可扩展性。最后，探索 CPU 和 GPU 中的高效工作流程，为需要高效分析大数据的用户建立指南和建议。

图1 PCA 基准测试和单细胞工作流程比较概述。(a) 单细胞数据处理工作流程的典型步骤示意图，包括质量控制、过滤、归一化、高变异基因选择、降维（PCA、UMAP、t-SNE）、SNN 图和聚类（Louvain、Leiden）。(b) 用于比较完整工作流程的基于 R 和 Python 的单细胞 RNA-seq 分析框架列表：OSCA、Scrapper 和 Seurat（R）；Scanpy 和 rapids singlecell（Python）。(c) 基准测试中评估的 PCA 实现总结，按编程语言（R 或 Python）、计算类型（CPU 或 GPU）、输入数据格式（稠密矩阵、稀疏矩阵或 HDF5）、库名称和中心化计算进行分类。该表还列出了每种方法支持的 SVD 算法（随机、精确、IRLBA、增量 PCA、ARPACK、Jacobi）

所有方法在 PCA 结果上均表现出高度一致性，且截断方法的准确性损失可忽略不计。基于 GPU 的 Rapids Singlecell 计算速度比最佳 CPU 方法快 15 倍，且内存使用量适中。在 CPU 上，ARPACK 和 IRLBA 对稀疏矩阵的效率最高，而随机化 SVD 对 HDF5 数据表现最佳。在完整的流程中，Rapids Singlecell 速度最快，而 OSCA 和 Scrapper 在已知细胞身份的数据集上实现了最高的聚类准确性（ARI 高达 0.97）。性能差异主要源于高变异基因（HVG）的选择和主成分分析（PCA）的具体实现。该研究强调，单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析的可扩展性严重依赖于算法和基础设施两方面因素。GPU 加速和优化的 BLAS/LAPACK 配置显著提升了性能，而基于 Bioconductor 的流程则保持了较高的准确性。所提供的基准测试为高效可靠地分析大规模单细胞数据集提供了实用指南。

参考文献

[1] Ilaria Billato, Hérve Pagès, Vince Carey, Levi Waldron, Gabriele Sales, Chiara Romualdi, Davide Risso. Benchmarking large-scale single-cell RNA-seq analysis. bioRxiv 2025.10.28.681564; doi: https://doi.org/10.1101/2025.10.28.681564

以往推荐如下：

1. 分子生物标志物数据库MarkerDB

2. 细胞标志物数据库CellMarker 2.0

3. 细胞发育轨迹数据库CellTracer

4. 人类细胞互作数据库：CITEdb

5. EMT标记物数据库：EMTome

6. EMT基因数据库：dbEMT

7. EMT基因调控数据库：EMTRegulome

8. RNA与疾病关系数据库：RNADisease v4.0

9. RNA修饰关联的读出、擦除、写入蛋白靶标数据库：RM2Target

10. 非编码RNA与免疫关系数据库：RNA2Immune

11. 值得关注的宝藏数据库：CNCB-NGDC