2024年5月20日，美国斯克里普斯研究所金鑫团队在Cell杂志上发表题为“Massively parallel in vivo Perturb-seq reveals cell type- specific transcriptional networks in cortical development”的文章， 阐述了如何在体内模型中进行高通量的细胞特异性基因功能研究。

In vivo Perturb-seq结合CRISPR-Cas9基因编辑和单细胞转录组测序，可以同时读取每个细胞的转录组和遗传扰动信息（gRNA序列），并通过对比不同遗传扰动后的转录组变化来研究基因在不同细胞中的功能。

作者利用AAV和转座子系统实现了快速高效的标记和基因编辑，大幅提高了体内高通量CRISPR筛选的效率和能力，为同时研究多个基因在不同细胞类型中的功能提供了灵活的工具，从而更好的理解不同基因在各种生理过程和疾病中的作用机制。

细胞是人体组织的基本单位。成千上百种细胞构成了我们身体的各个器官，而通过其独特的基因表达模式每种细胞得以在特定器官中执行特定的功能。数十年的人类遗传学研究令我们掌握了许多与各种人类疾病密切相关的风险基因。然而，我们对这些基因的研究还存在许多局限。比如，一个基因在同一种器官中可能会影响一种或多种细胞类型，且在不同的细胞类型中产生不同的作用。因此，为了进一步了解疾病的发生机制并开发出相应的疗法，揭示这些基因如何影响不同的细胞类型至关重要。然而，如何大规模的对多个风险基因在多种类型细胞中的作用进行高效准确的研究还并不清楚。

我们常用的神经系统基因编辑递送系统通常较需要几天到几周的时间才能在大脑中表达并发挥作用，并不利于研究高度动态的大脑发育过程。为此，作者筛选了86种不同血清型的AAV并发现AAV-SCH9可以在48小时内在多种神经细胞中高效表达转基因。这种快速高效表达的特性使得基因编辑可以在体内快速作用于靶向细胞，更好地捕获大脑发育过程中的关键时间窗口。除此之外，作者还发现将AAV系统和转座子系统结合，能帮助转基因整合入宿主细胞的基因组，以此提高了转基因的表达水平并实现了在小鼠胚胎大脑和成年小鼠的中枢和外周神经系统的高效表达。至此，该方法显著扩大了体内CRISPR筛选的规模：在一次实验中能够分析超过3万个细胞，比传统方法多了10-20倍。

作者进一步利用Massively parallel in vivo Perturb-seq系统深入研究了对小鼠大脑皮质发育起到重要作用的4个转录因子。利用单细胞转录组分析，作者发现这些基因的敲除在不同的细胞类型中会引起不同的表型，包括不同类型细胞的占比变化和特定基因的差异化表达。其中，Foxg1在皮质神经元命运决定中起到了重要的作用，Foxg1的功能丧失解除了其他转录因子调控网络在Layer VI皮质-丘脑神经元命运的抑制，这种表型并不存在于其他的细胞类型中。

图文摘要

综上所述，本工作开发了高通量的体内CRISPR筛选平台Massively Parallel in vivo Perturb-seq，这种高通量筛选方法可以与不同类型的AAV递送方式和组学研究结合，同时研究多种基因在复杂组织中不同细胞类型中的功能，为复杂疾病的研究和治疗提供新的启示。

斯克里普斯研究所金鑫教授为该论文的通讯作者，博士研究生郑心和为该论文的第一作者。本研究受到了Broad Institute的 Joshua Levin组，加州大学尔湾分校的Xiangmin Xu组，康奈尔大学医学院的Zhuhao Wu组和早稻田大学的Carina Hanashima组的大力支持。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.050