根结线虫如何进行分子鉴定？这个问题看似简单，但是极为复杂。简单在于稍有分子基础的研究人员都知道可以通过核糖体基因测序，在GenBank中通过比对获得鉴定结果。而难的是选择合适的方法。实践中大多数用户的分子鉴定方法是完全错误的。一下列举几种常见的错误：

（1）采用核糖体18S，28S，ITS，COI鉴定所有根结线虫。

（2）以BLAST搜索结果中最相似的种为鉴定结果。

（3）认为相似度超过一定值就可以认为是一个种，如99%、98%、97%相似即为一种。 

对于根结线虫而言，这些错误在于部分种类基因组高度相似，其种间核糖体基因无差异，或种内差异和种间差异在同一范围。比如，当用一个爪哇根结的28S基因进行BLAST，结果会显示爪哇根结、南方根结、花生根结等多个种，且相似度均为100%，这时就无法知道输入序列是哪个种了，如下图：

有时，BLAST会得到另一种结果。这时看起来相似度由高到低排列，似乎最高相似度的就是鉴定结果。但其实仔细观察后可以发现这其实是种内差异大于种间差异的一种表现。与输入序列相似度最高的M.incognita在列表种出现了多次，与输入的序列有不同的相似度。而排列第三位的M.arenaria与第一位的序列有相同的相似度99.12%，且也以不同相似度在列表中出现了多次。这时候鉴定结果依然不可靠。

类似的情况同样出现在其他植物寄生线虫的鉴定中。线虫种的界定是一个复杂的问题，现有的物种界定方法无一以物种相似度的高低作为定种的关键因素。实践中为了方便非专业用户使用，人为的根据经验设定一些阈值，便于操作。这种情况在微生物中较为普遍，也较为成功。但线虫的情况远比微生物复杂，目前在植物线虫中没有一个固定的阈值。即有的类群中99%相似很可能是一个种，但在另一类群甚至可能是不同属。通常，靠相似度判断较为主观，很容易产生错误。其次，目前线虫中已有分子序列的类群仍然较少，若BLAST输入的种目前尚无序列，则只能出现最接近的种。此外，NCBI的线虫数据库存在大量鉴定错误的线虫序列，其中大部分来自非专业线虫分类研究人员。因此BLAST后最高相似度的种很有可能是鉴定错误种，甚至不是线虫！比如下面这个序列，标注为孢囊线虫，但其实是真菌序列。对这一问题Janssen et al., (2018)有更为详细的论述。

综上，对于根结线虫而言，部分类群基因组高度相似，常称为热带根结线虫或根结线虫MIG组，包括花生根结，南方根结，爪哇根结，埃塞俄比亚根结等，无法通过核糖体基因鉴定！直接进行BLAST搜索获得的往往是错误的鉴定结果。而非热带线虫组的其他类群根结线虫，如苹果根结，种间分子差异较大，大都可以通过28S或ITS基因进行鉴定。如不清楚是不是热带根结可以先进行BLAST比对，看大概与哪些种较为相似，再决定进一步采取哪种方法。

上图中最顶部蓝色的一支（clade I）及为热带根结组，该类群内的种无法用核糖体基因有效可靠的鉴定。álvarez-Ortega et al., 2019

对于热带根结线虫的鉴定，目前欧盟EPPO使用的方法是采用线粒中NAD5基因单倍型，即比较这几个种在特定基因位点的核苷酸。使用时可用NAD5引物进行扩增，将获得的序列在PPNID软件中进行搜索。具体方法见上一篇文章对PPNID介绍。