作物病原线虫引起的病害已成为农业生产中最重要的病害之一，全球每年因作物病原线虫造成的直接经济损失高达1570亿美元（Abad et al., 2008）。植物病原线虫的鉴定是植物线虫学研究的热点之一。然而作物病原线虫体型较小，通常小于2mm，给形态特征的识别带来较大困难。形态鉴定需要对活体线虫进行固定并通过复杂的过程制作玻片标本，期间需要花费大量人力和时间，实践中难以同时对大量线虫进行鉴定。此外，通常植物线虫种内与种间形态均存在变异，两者差异范围往往存在重叠，这使得人为鉴定极为困难且随机性较大。加之准确的线虫形态鉴定受制于鉴定人的经验积累，但世界范围内专业从事线虫形态分类鉴定的科研工作者逐年减少(Coomans, 2005)，因此目前以形态为基础的分类鉴定面临极大的挑战。

近年来，测序技术逐渐普及，成本不断下降，基于DNA条形码序列的分子鉴定逐渐成为主流技术。此方法提取单条虫并进行Sanger测序，通过比对基因序列对物种进行鉴定，具有准确度高，可重复性强的特点。但正确的条形码基因选择与序列分析解读对于鉴定结果至关重要。然而，这对大多数非线虫专业人士而言存在较大困难。实践中，大多数人选取核糖体28S或ITS基因，将测序结果在BLAST中做比对，选取相似度最高的作为鉴定结果。这一方式存在较大问题：BLAST结果中百分之几的相似度可以认为一个种？部分根结线虫28S rDNA 100%相似仍然可能为不同种，这些类群基因组极度相似，仅能够通过特定位点的SNP进行区分；而部分垫刃科线虫93%差异往往仍认为是同一种。线虫中目前尚无统一阈值，不同类群，不同基因都可能有很大的差异，这需要大量前期知识，且判断时非常主观。此外，不同于真菌与细菌，NCBI中线虫数据库存在大量错误 (Janssens et al., 2018; Qing et al., 2019)，比对获得的线虫序列往往信息不全，甚至可能获得真菌序列，降低了鉴定结果的可靠性。

针对这些问题，从2018年起，我在以色列农业研究中心进行博士后研究期间联合荷兰植保所与根特大学合作开发植物病原线虫条形码鉴定软件PPNID。该软件将复杂的线虫分子鉴定过程模块化，将所有需要考虑的因素都整合至软件中。用户不需要线虫学与生物信息分析基础，只需要简单的粘贴序列至软件中即可自动完成序列的比对，统计学辅助鉴定，以及极大似然进化树的构建。相比BLAST比对，本方法考虑了不同基因与线虫类群间的差异，采用系统进化种的定义进行物种界定。同时使用自建的参考序列库，人工剔除GenBank中错误，重复或未标记的序列，确保获得的比对信息可靠有效。对于核糖体基因无法区分的热带根结线虫，本软件引入SNP识别系统，通过搜索SNP进行种的鉴定。PPNID是目前首个植物线虫条形码数据库和分析鉴定软件，可简化植物线虫分子鉴定的操作步骤与人为因素，提升鉴定效率。

详细信息见：

Qing X. et al. PPNID: a reference database and molecular identification pipeline for plant-parasitic nematodes, Bioinformatics, 2019, DOI:10.1093/bioinformatics/btz707

该软件可以通过Github进行下载：

https://github.com/xueqing4083/PPNID

相关教学视频：

https://www.bilibili.com/video/av92946040/

图1： PPNID鉴定过程原理图

图2：PPNID用户界面