我们的文章“The conformational wave in capsaicin activation of Transient Receptor Potential Vanilloid 1 ion channel”终于在Nature Communications上发表了，我的习惯是对自己比较看重的工作做一个梳理，记录下自己在这个时候对这个工作的思考，以后回顾起来肯定很有意思。

https://www.nature.com/articles/s41467-018-05339-6

这篇文章是我们围绕同一个主题的一系列工作的重要部分。我们想搞清楚的，其实就是一个问题：为什么吃辣椒会感到辣？

在我们之前，辣椒里面引起辣的感觉的化学物质辣椒素capsaicin（CAP）早在上个世纪初就得到了鉴定，而辣椒素的受体TRPV1离子通道也在二十多年前被发现。那么，在原子水平，辣椒素是怎么打开它的受体TRPV1通道呢？这不是一个容易回答的问题。2013年，冷冻电镜技术的突破给我们带来了高分辨率的静态TRPV1通道三维结构，以此为契机，我们循序渐进，开展了三个主要研究：

1.      2015年在Nature Chemical Biology上的工作主要回答了辣椒素是如何与TRPV1通道结合的；http://blog.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=796366&do=blog&id=896597

2.      2016年在PNAS的工作，主要从蛋白质理性设计的角度，实现了对辣椒素敏感性的转移，是对2015年工作的一个有力验证；http://blog.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=796366&do=blog&id=984440

3.      而今年在NC的工作，主要回答了辣椒素与TRPV1通道结合之后，是如何引起通道的动态构象变化，最终让通道打开的。所以这三篇工作加在一起，基本建立了一个比较完整的框架，让我们能够在蛋白质结构的原子层面，较清晰地回答辣椒素是如何激活其受体的了。

那么，今年这篇工作做了什么呢？我认为，首先需要放在时代大背景下来看。生物学今天所处的时代，是以冷冻电镜技术为代表的结构生物学的黄金时代。结构生物学家们为我们揭示了一个又一个蛋白质的静态高分辨率结构，包括TRPV1通道。那么是不是有了结构就万事大吉，到end of the story了呢？其实，我认为高分辨率静态结构恰恰是打开新大门的钥匙。同样以TRPV1通道为例，其辣椒素结合状态的三维结构为我们清晰地指明了辣椒素分子的结合口袋，为我们接下来阐明辣椒素和通道蛋白相互作用的细节打下了基础；然而，TRPV1通道有上下两个“闸门”，它们共同决定通道是否能让阳离子通过，在辣椒素结合状态的冷冻电镜结构里，下闸门已经处于开放状态，而上闸门还在关闭状态，所以很明显地，这样的一个结构反映的并不是生理状态下TRPV1通道被辣椒素激活开放时的构象。怎么办？

我们认为，既然在动物和人体内辣椒素一定能完全地打开TRPV1通道，那么和冷冻电镜结构相比，该通道的上闸门附近一定发生了某种动态构象变化，从而使得上闸门和下闸门一样处在开放状态，进而允许离子流过。那么，如何在近似生理条件的活细胞中，而不是在通道蛋白被纯化被冰冻后的体外环境中，直接观测通道上闸门附近的构象变化呢？我们采用了一种基于非天然氨基酸的荧光成像技术。我们知道，很多荧光分子的荧光性质，如吸收光谱发射光谱这些，会受到周围化学环境的影响发生改变，从而可以反映出标记荧光分子的位点周围的局部构象变化。但问题是，传统的荧光分子如罗丹明、荧光素、荧光蛋白这些，其分子本身比较大，而且需要一个比较长的linker来固定到蛋白质上的某个位点，所以它们反映局部构象变化的灵敏度是有所欠缺的。怎么办呢？我们采用了一种荧光非天然氨基酸ANAP。ANAP自身就是荧光分子，分子比较小，而且可以通过分子生物学的方法把ANAP整合到蛋白质上任意一个位点。ANAP的发射光谱对周围环境的疏水性很敏感，所以我们通过把ANAP标记在TRPV1通道蛋白的不同位点，就可以直接观测其发射光谱在辣椒素激活时的变化，从而得知标记的位点周围是否发生了构象的动态变化。我们发现当ANAP标记在上闸门附近的T651和Y654位点时，的确能发现辣椒素激活引起的发射光谱变化，即是说辣椒素的确能引起上闸门附近的动态构象变化。

那么，上闸门究竟被辣椒素的激活变成什么样了呢？我们把来自ANAP的荧光信号在计算结构生物学工具包Rosetta里进行整合，从而算出了能够满足荧光实验数据的TRPV1通道上下闸门同时处于开放状态的三维结构模型。我自己一直对计算结构生物学很感兴趣，也是从自己做博士后到独立建立实验室以来的一个主要研究方向，所以能在这个工作里成功地实现把来自wet lab的实验数据与in silico计算进行有机整合，得到有意义的三维结构模型，让我觉得很开心。

得到了上下全开的TRPV1通道模型之后，问题又来了：这两个闸门在被辣椒素开启的时候，是同时被打开，还是按照一定的时间顺序被先后打开？我们进行了大量的点突变和单通道电生理记录，最终通过Φ分析的方法，推测出在辣椒素和TRPV1通道蛋白结合后，能引起一个“构象波”：即辣椒素首先引起它的结合口袋周围的构象变化，然后让通道的下闸门发生构象变化，最后构象波传到上闸门，让那里发生构象变化，最终使得通道处于完全开放的状态。从单通道记录可以明显地看出，任何一次TRPV1通道从关闭态转化到开放态，都是在微秒级别的时间内完成，所以Φ分析的优势就在于，它能获得在活细胞中，在极短时间内完成的蛋白质构象变化过程的时间顺序，而这些信息无论通过荧光成像还是其它方法都是难以获取的。这样说起来，Φ分析在理论上是一个研究离子通道蛋白质构象变化的时间顺序的标准方法，然而在实际操作中，为什么它的应用并不广泛呢？那是因为Φ分析做起来不容易。想想看，得在数十个位点上把每个位点还得突变成5个左右不同得氨基酸，对每一个突变体进行真正的单通道记录，不光是工作量的问题，更在于对每一个突变体都得摸索合适的条件，再加上好运气，才能得到可以用的单通道记录。幸好我们合作者里有肖弦博士（她是我的妻子:P），她过硬的单通道电生理技术让Φ分析变得可能。Φ分析一旦能做出来，得出的结果都很有意思，如Tony Auebach实验室在乙酰胆碱受体受体上用Φ分析观察到了配体结合引起的构象波，发表在Nature和NC上；Csanady实验室同样用Φ分析观察CFTR的配体门控引起的构象波，最后发表在Cell上。我盼望以后技术的进步能让单通道记录变得更自动化和高通量，Φ分析这样一个能提供构象变化时间信息的方法才真正有可能被广泛地使用。

Φ分析的结果恰恰又成了我们在这个工作里的一个小遗憾：我本来想把Φ分析的结果与分子动力学模拟相结合，得出一个在实验数据约束下的、更接近真实状态的蛋白质动态构象变化的movie，把辣椒素激活的过程可视化。然而，我查了很多资料也问了不少做MD的专家，似乎现在还没有很好的办法来进行这样的“实验数据+计算”的整合。所以，这个遗憾也是我们今后的努力方向之一。

从长远来看，我觉得结构生物学的发展方向之一是实现对蛋白质三维结构观察由静到动，由某个特定构象到一系列构象波的跨越。所以，这篇文章中采用的将活细胞中的各种wet lab实验数据通过计算生物学的手段进行整合，将是实现这样跨越的一条途径，至少是我想积极探索的一条途径。

最后给自己实验室打个广告，我实验室将致力于离子通道蛋白与配体分子相互作用的研究，同时将得到的知识进行转化，进行离子通道调控分子的理性设计，所以长期诚聘有电生理或蛋白质表达纯化或计算生物学相关经验的博士后和技术员：http://hr.zju.edu.cn/postdoctor/redir.php?catalog_id=68088&object_id=88621