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作者：小哈  来源：嘉因

大家都会做方便面，有人做辛拉面，有人做三鲜伊面，工艺有何不同？

大家都会做RNA-seq，有人能筛出有意义的基因，有人能找出有价值的线索，有人。。。差别在哪？

前三期介绍了数据均一化处理、差异基因筛选和画heatmap的合理方法：

第一期：数据预处理：同一套RNA-seq，为什么公司做的跟师兄跑的结果不一样？ | TPM、read counts、RPKM/FPKM你选对了吗？

第二期：差异基因筛选：同一套RNA-seq，公司筛出的差异基因跟师兄筛出的为什么不一样？| Pvalue, FDR, cutoff

第三期：heatmap：heatmap画不好会得出错误结论 | 数据预处理、聚类分析，HCL、 K means里的讲究

本文看富集分析有啥讲究？

在最靠谱的富集分析，超炫的展示方式，TCGA也是他的粉丝【老客户福利】一文中谈到，clusterProfiler的优势之一是注释最新，大部分工具做KEGG富集分析用的都是2012年的版本，只有clusterProfiler实时抓取KEGG最新版数据做富集分析。

2016年8月，有人专门吐槽各种富集分析工具用的注释有多老，探讨过时的注释对富集分析结果的影响。

3900篇文章中67%用的工具注释版本古老，只用到了当前biological processes和pathway注释资源的26%。其实GO注释每天都在更新，Pathway数据库例如Reactome和PathwayCommons每个季度都在更新。42%的工具超过5年没更新，例如被引用次数超级高的DAVID，没错，就是那个鹤立鸡群的红色bar：

DAVID当时的版本是2010年的，被吐槽后两个月，2016年10月终于更新到目前的版本。

五年来，注释文件发生了哪些变化呢？

Biological process的GO注释term是5年前的2倍，Reactome Pathway的注释term是5年前的1.5倍。

人和小鼠的注释是5年前的2倍，其他模式生物缓慢些，1.3倍。

多数gene参与的pathway数从2010年的10个增加到2016年的16个。

GO注释中有些是计算机自动给出的，叫做电子注释，IEA（inferred from electronic annotations），2009年电子注释IEA占37%，2016年，IEA仅剩14%。也就是说，目前86%的注释都是有实验证据的，比5年前更可靠。

未注释的蛋白从5年前的12.4%降到4.9%，蛋白质功能注释越来越全了。

过时的注释会对富集分析结果造成哪些影响呢？

举个栗子，具体分析一套数据。

紫色是用2016年的注释做富集分析得到显著富集的term数，再看2010年的黄色，呵呵！

用2010年的注释做富集分析，丢掉了好多pathway。只有用2016年的注释才能找出紫色的圆圈。

赶紧看看自己的数据是拿什么年代的注释做的富集分析，是不是该更新了？或许会有更interesting的发现呢！

最后看statQuest用m&m豆讲富集分析原理