第三代DNA测序平台Pacific Bioscience 介绍和测试结果

太平洋生物(Pacific Bioscience, or PacBio) 近期推出了新的第三代DNA测序平台，这是单分子实时测序的一种技术(Single molecule real time sequencing)。这项技术通过合成的方法可以同时对成千上万个DNA分子测序。它的单个DNA片段测序长度能达到1kb。 并且测序时间短，从准备Library到最后序列出来只需两天。是一项很有希望实现便宜的个人基因组测序的技术。

这项技术的核心在于使用了Zero-Mode Waveguide(ZMW)(零波段边界)。测序的平台上有几万个小井，单个DNA聚合酶和要测序的DNA链固定在每一个小井里。带有荧光标记的脱氧核苷酸(A,T,C,G)被加入到每个小井里。每一种脱氧核苷酸在激化后分别能放出不同波长的荧光。小井的底部开了一个非常小的孔，小到比探测激光的单个波长还要短。根据我们的常识，这个孔太小了，激光无法从井的底部穿过去，从而无法激发脱氧核苷酸上的荧光物质。应此，底部的显微镜检测到的是一片黑暗。但是我们知道光线是一种波，它会衍射，激光虽然不能完全穿过小孔照亮整个小井，但它能透过小孔而勉强照亮小孔附近很小的一个区域。而DNA聚合酶正好被固定在这个小区域。当有单个脱氧核苷酸加载在DNA聚合酶上形成新的化学键时，这个脱氧核苷酸上的荧光物质被激活而发光，从而被显微镜观测到。这种特定颜色的荧光只持续一小段时间，应为这个碱基在DNA链上合成之后，它的荧光基团就会被剪切掉，从而继续下一个碱基的合成。当DNA链合成结束之时也是DNA链测序完成之时。但DNA聚合酶的活性会在激光照射下逐渐减弱，不能无限长度的进行合成反应，因此DNA链的测序长度也是有限的。

但是这项技术的缺点是测序误差太大，他们宣称单次测序错误率平均为15%。因此他们提出了循环测序的方法来弥补。他们将DNA链的两端链接起来，形成一个环。这样DNA聚合酶就在这个环里不停的循环合成新的DNA链，对同一个碱基进行多次测序。比如说，如果一个DNA环是100bp，循环测序5次的话，测出来的序列就500bp.在后期的计算中，将500bp截断成5个100bp的，做一下序列的比对，就可以还原出原始的序列了。他们号称错误率在1%以下。

PacBio的总部就在斯坦福大学的隔壁，我们组有一台Pacific Bioscience的测试版的仪器。我们对PacBio很感兴趣，就拿来测试了一下。我分析了一下测试结果。

首先，Library 和SMRTBell的准备快速而简单。测序时间确实很短。

其次，合成的DNA链长度可以达到3kb，确实比目前所有的高通测序仪都高。

最致命的是误差问题。结论是单次测序错误率15%, 循环测序误差8%左右，仪器目前的性能很令人失望。我自己写了个程序来做序列对比，能把误差降到3%左右，相比起其454来，还是有很大的差距。PacBio目前还不足以投放市场。他们的软件部分实在是需要改进。

 

 

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