氢水对结肠炎效应的实验研究【哈佛】

通过其抗氧化作用，分子氢（H2）被报道能够保护器官免受缺血再灌注引起的组织损伤。为了评估其抗炎效果，我们建立了一个人类炎症性肠病（IBD）的小鼠模型，通过向小鼠提供含有以下物质的水：(1) 5% 右旋糖酐钠（DSS）、(2) 5% DSS和氢气、或(3) 仅氢气，持续7天。在第7天时，DSS诱导的病理结果，包括体重减轻、结肠炎评分增加、结肠长度的病理缩短、结肠病变中IL-12、TNF-α和IL-1β水平的升高，都因DSS溶液中加入氢气而显著受到抑制。组织学分析还显示，由DSS介导的结肠组织破坏伴随巨噬细胞浸润，在氢气的作用下明显受到抑制。因此，本研究表明氢气可以预防DSS诱导的小鼠结肠炎的发展。

引言

分子氢（H2）被认为具有抗氧化效果。以前的研究证明，以气体形式或溶解在水中的氢气可以抑制由缺血再灌注引起的大脑、肝脏和心脏的组织损伤。与其他气体分子如NO或O2不同，小分子氢气能够穿透固体物质，甚至是塑料。得益于这种快速渗透能力，尽管氢气消除氧化应激的精确化学机制尚待阐明，但摄入中性pH值的氢气水被认为是一种强效抗氧化剂，因为它具有极其负的氧化还原电位值。然而，氢气对除缺血再灌注外其他机制引发的炎症的影响仍有待阐明。

右旋糖酐钠（DSS）诱导的啮齿动物结肠炎已被报道为人类炎症性肠病（IBD），特别是溃疡性结肠炎的动物模型。DSS是一种硫酸化的多糖，干扰上皮细胞屏障功能。这暴露了固有层于腔内细菌抗原之下，进而引发先天免疫的激活[8]、[9]。当应用于小鼠饮用水中时，DSS会诱导结肠炎，其特征是体重减轻、腹泻和/或明显的血便，以及肠道炎症的组织病理学特征，即隐窝糜烂。

受损的抗氧化机制被认为是DSS诱导的结肠炎的致病原因之一[11]。由于炎症和氧化过程相互关联，因此，氢气的抗氧化效果应该通过抑制在结肠炎病变中表达的促炎细胞因子，如IL-1β、IL-12和TNF-α来防止其发展[15]、[16]、[17]。特别是，这些促炎细胞因子被认为是负责DSS诱导的小鼠结肠炎以及人类IBD中的组织破坏[6]、[18]、[19]。然而，由于不清楚摄入氢气水是否能有效地预防或抑制DSS诱导的结肠炎的炎症结果，我们检查了溶解在水中的分子氢气对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响。

动物。BALB/c小鼠（8-10周龄雄性，n=6/组）在无特定病原体（SPF）条件下笼养。动物被保持在一个温度恒定的常规房间内，有12小时的光暗循环。本研究中使用的实验程序得到了Forsyth IACUC的批准。

测量分子氢。使用针式氢气传感器（Unisense A/S, Aarhus, Denmark）按照Hayashida等人发表的方法测量水中或小鼠器官中的分子氢（H2）。

生成溶解氢气的水。将高纯度氢气气（Airgas East, Salem, NH）注入水、林格氏溶液或含5% DSS的水中，直到氢气浓度达到饱和（0.78 mM，在25°C下）。

DSS诱导的结肠炎的诱导。在第0天，对照组常规蒸馏水、溶解在蒸馏水中的DSS（5% [重量/体积]，30-40 kDa；Acros Organics, Morris Plains, NJ）无论是否含有饱和氢气，或仅含饱和氢气的蒸馏水，都被作为饮用水随意提供给小鼠，使用带有橡胶顶和金属管的饲养玻璃瓶（Schott Duran, Mainz, Germany）。新鲜含有饱和氢气的水的生物物理性质显示：（1）氢气浓度，0.78 mM；（2）pH值7.43～7.76；（3）氧化还原电位（ORP）-462至-511 mV。24小时后，这些值被测量为（1）氢气浓度，0.39～0.42 mM；（2）pH值7.34～7.63；（3）ORP -388～-420 mV。每天准备新鲜的DSS溶液，无论是否含有氢气，以及仅含氢气的水。在接下来的7天内，每日监测小鼠以测量体重和结肠炎评分。7天后，小鼠被处死，并收集结肠组织。结肠在最靠近回盲瓣和直肠的两个位置被移除，并测量长度。远端和近端的结肠部分（各1厘米）被固定并包埋在OCT复合物中进行组织学分析。剩余的结肠部分被称重并在液氮中冷冻，用于检测细胞因子。

葡聚糖硫酸钠盐（Dextran Sulfate Sodium Salt, DSS）是一种聚阴离子衍生物，其诱导结肠炎模型的机制虽仍未十分明确，但通常认为与巨噬细胞功能失调、肠道菌群失调、DSS对结肠上皮的毒性作用、细胞因子在DSS结肠炎模型的发病中起重要作用等机制有关。

结肠炎评分。在DSS诱导期间，由训练有素且对治疗组别盲的人员每天评估结肠炎评分。第0天确定基线结肠炎评分。简而言之，无体重减轻评分为0；从基线起体重减轻1-5%评为1；5%到10%评为2；10%到20%评为3；超过20%评为4。对于粪便一致性，成形良好的粪便评为0分，糊状半成形不粘肛门的粪便评为2分，液体粪便粘肛门的评为4分。对于出血，无血评为0分，隐血阳性评为2分，明显出血评为4分。这些分数相加后除以三，得出总临床评分范围从0（健康）到4（结肠炎最大活动性）。

组织学评估。横结肠远端部分的组织切片（8 μm）用苏木精和伊红（H & E）染色。根据炎症的数量和深度以及隐窝再生或损伤的程度进行组织学评分[21]。简而言之，评分如下：(1) 炎症数量：无，0；轻微，1；中度，2；重度，3 (2) 炎症深度：无，0；粘膜层，1；粘膜和粘膜下层，2；全层，3 (3) 隐窝损伤：无，0；基底1/3受损，1；基底2/3受损，2；仅表面上皮完整，3；整个隐窝和上皮丢失，4。每个特征分别评分，并将分数相加得到单个结肠样本的最终组织学评分。

F4/80阳性巨噬细胞的免疫荧光鉴定。结肠组织切片用丙酮（50%）和甲醇（50%）混合物固定。结肠中的巨噬细胞用与生物素偶联的抗F4/80单克隆抗体（Rat IgG2b, AbD Serotec, Oxford, UK）染色，然后用FITC-Avidin（BD Pharmingen, San Diego, CA）显色。使用与生物素偶联的无关大鼠单克隆抗体（BD Pharmingen）作为对照。使用Leica TCS/SP-2激光扫描共聚焦显微镜在×400放大倍数下分析染色模式。

ELISA。横结肠组织被用Dounce玻璃匀浆器在补充了0.05% Tween 20、苯甲基磺酰氟（1 mM；Sigma, St. Louis, MO）和蛋白酶抑制剂混合液（Sigma）的PBS中匀浆，然后以18,000 rpm离心10分钟。得到的上清液用于ELISA测定TNF-α（Mouse TNF-α ELISA MAX™ Set, Biolegend, San Diego, CA），以及IL-1β或IL-12p40（Murine ELISA Development kit, Peprotech, Rocky Hill, NJ）。 

本研究证明了H2可以通过下调促炎细胞因子的表达以及抑制巨噬细胞在结肠病变中的浸润，来减轻DSS诱导的结肠炎。H2的给药显著减少了DSS诱导结肠炎的临床症状，包括体重减轻、可见的粪便血迹和腹泻、结肠炎评分以及结肠长度的缩短。组织病理学评估进一步支持了H2在预防DSS介导的上皮隐窝结构破坏方面的效果。因此，这是第一个证明H2可以抑制包括IL-1b、IL-12和TNF-a在内的组织破坏性促炎细胞因子在结肠产生的研究。然而，活性氧（ROS）可以通过上调NF-jB信号通路激活TNF-a的表达，同时，它还可以激活NADPH氧化酶（NOX）的表达，该酶从NADPH中产生ROS。因此，炎症和氧化过程是相互关联的。

ROS和促炎介质之间的交叉反应复杂性表明，H2介导的促炎细胞因子抑制作用，如在DSS诱导的结肠炎中所表现的，可能也涉及H2的抗氧化效果。尽管如此，由于已经提出各种炎症介质，特别是IL-1b、IL-12和TNF-a，参与人类和小鼠结肠炎的发病机制和恶化，H2对这些细胞因子的抑制似乎在减轻DSS诱导的结肠炎中发挥了作用。

此外，H2的给药似乎抑制了巨噬细胞的活化，因为在接受DSS处理的小鼠中，F4/80阳性巨噬细胞的迁移被H2显著抑制。巨噬细胞也是人类IBD中产生促炎细胞因子的主要炎症细胞之一。

RAW264.7细胞（一种小鼠巨噬细胞系）在体外用LPS刺激时对TNF-a的表达，在培养基中溶解有H2的情况下显著受到抑制（未发表的数据）。因此，假设H2介导的DSS诱导结肠炎的缓解源于H2对巨噬细胞响应肠腔内细菌抗原（如LPS）激活的抑制效应。