生命礼赞：炎症小体和细胞死亡信号！（Vishva Dixit）

The road to death: Caspases, cleavage, and pores | Science Advances

Vishva Dixit讲述了他30多年来最喜欢的发现，这些蛋白质使受感染，受损或过时的细胞死亡。看到这些学术贡献，都已经达到了真正发现的境界，这些发现都是对我们人类知识的丰富和完善，这样的发现都是值得授予诺贝尔奖的学术贡献。作为一个来自非洲贫困国家农村孩子，能经过自己努力一步步走到今天的学术圣殿，值得敬佩。他的故事给我们年轻学者们从事科学研究的态度提供了借鉴。从事学术研究，绝对不是发表几篇能被杂志接受的学术论文，而是给人类知识更新提供新的素材。

Vishva M. Dixit是美国基因泰克（Genentech）公司的副主席，作为一名病理学家，他对细胞死亡和炎症信号的分子机制研究做出了巨大的贡献。他的突破性发现是，半胱氨酸蛋白酶(caspase)是死亡受体诱导细胞凋亡通路的组成部分。1986年，他加入密歇根大学(University of Michigan)病理学系，担任助理教授。在晋升为教授后，他于1997年离开，加入基因泰克，担任肿瘤学主任。

作为一个在50-60年代在肯尼亚村庄长大的孩子，我有一个生动的梦想，那就是探索和寻找新的土地。成年后，生物医学领域给我提供了探索未知的兴奋、喜悦、惶恐和不确定性。我的职业生涯有一个曲折的开始。我在肯尼亚完成医学院的学业，然后在密苏里州圣路易斯的华盛顿大学完成病理学培训和生物化学奖学金。随后，我做了两份工作——第一份在密歇根大学安娜堡分校的学术界工作，第二份在工业界，在南旧金山的基因泰克公司工作。我有幸有许多发现，其中有两个很突出：阐明死亡受体如何发出信号并找到非规范的炎症小体途径。本文是围绕这两个发现的起起落落的个人回忆。

一、细胞死亡受体信号传导

作为一名在 1980 年代后期研究血液凝固的病理学家，我希望进入新的和更令人兴奋的研究领域。细胞凋亡是一种免疫沉默的细胞死亡形式，看起来很有希望。病理学家Andrew Wyllie，Alastair Currie和John Kerr最近在哺乳动物组织中表征了细胞凋亡的形态学特征，并且正在出现潜在遗传程序的证据。我想知道我是否可以梳理出引发细胞凋亡死亡的信号通路。

我接受过少量的生物化学培训，但我缺乏一个简单且可扩展的细胞培养系统来同步触发细胞凋亡。有一段时间，找到这样一个系统感觉像是一件愚蠢的事情。Shin Yonehara和Peter Krammer在1989年解决了这个问题，当时他们描述了一种诱导培养细胞凋亡的单克隆抗体。现在，鉴定抗体参与的细胞表面受体的竞赛正在进行中。

强大的永田茂和在1991年克隆并表征了该受体，此后命名为Fas/Apo-1/CD95。该受体在序列上与肿瘤坏死因子（TNF）的主要受体高度相似，后者也可能参与特定的细胞系以诱导细胞凋亡。为简单起见，我将这些受体都通称为“死亡受体”。

有趣的是，死亡受体的胞质部分并没有揭示细胞凋亡信号的明显模式。死亡受体都没有酶结构域，如激酶，也没有用于翻译后修饰的结合基序。然而，著名的分子生物学家David Goeddel指出，它们都含有大约80个残基的保守胞质片段。这些残基的突变使死亡受体失效并阻止它们发出细胞凋亡信号，导致他的小组在1993年将这一部分命名为“死亡域”（缩写为DD）。我现在有一个系统来处理死亡受体下游的“死亡途径”。

这应该是我追求童年梦想的一个机会，寻找全新事物。我推测，回答问题取得突破唯一方法应该是找到细胞死亡的抑制剂。当时，我确信，纯粹的勇气和决心将从数千种市售化学品（即Sigma-Aldrich目录）中筛选到抑制剂。这些抑制剂将是让我能够阐明死亡受体下游神秘成分的工具。

事实证明，艰苦的工作是容易的部分。一位聪明而雄心勃勃的医学博士/博士生Muneesh Tewari和技术员Karen O'Rourke帮助建立了该系统。我们首先使用基因泰克的重组TNF或Fas激动剂抗体轻松诱导出细胞凋亡。显微镜下随之而来的混乱令人着迷。经历了一场令人难忘的暴力死亡之舞。细胞核凝结，细胞膜起泡，然后细胞分解成膜封闭的囊，称为凋亡体。但是，我们鉴定细胞凋亡化学抑制剂的努力陷入困境。无论我们测试什么，要么不起作用，要么只有边际效应。我们想知道该途径的组件是否可能具有内置冗余。如果真是这样，完成这一计划项目就彻底没有了希望。（研究似乎进入到死胡同！）

与此同时，看似不同的研究路线为细胞死亡领域提供了重要线索。1992年，Roy Black和Nancy Thornberry描述了一种最不寻常的半胱氨酸蛋白酶，他们称之为白细胞介素-1（IL-1）转换酶或ICE。不寻常的特异性是，ICE在天冬氨酸残基后裂解IL-1。它在序列上也与Robert Horvitz在3年发现的秀丽隐杆线虫死亡基因ced1986编码的蛋白质非常相似。Horvitz的实验室在1993年表明，ced3编码了一种蛋白酶，其底物特异性和性质与ICE相似。（这个时期，发现了死亡受体，发现了死亡受体下游的酶，单这个时候不知道死亡受体能激活这种酶）

死亡受体是否激活了类似ICE的蛋白酶？（灵光乍现）我们意识到我们必须迅速测试这个概念，因为该领域正在迅速发展。我们知道杜克大学的David Picking和Guy Salvesen已经在痘病毒编码的Serpin中发现了一种有效的ICE抑制剂，称为CrmA。他们慷慨地向我们发送了 CrmA 的表达式结构。

一天傍晚，我们挖到了金子。凝视显微镜，就像霍华德·卡特凝视图坦卡蒙的坟墓一样，我们看到CrmA完全抑制了死亡受体激动剂诱导的细胞凋亡（图1A）。结论是明确的。死亡受体必须与ICE或ICE样蛋白酶结合以启动细胞凋亡（1）。在后续研究中，Muneesh确定了类似ICE的刽子手蛋白酶，并将其称为印度教死神YAMA（2）。ICE和YAMA是哺乳动物蛋白酶家族的创始成员，称为半胱天冬酶，最终分别更名为半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-3。半胱天冬酶的名称表示它们是半胱氨酸蛋白酶（c），在天冬氨酸残基（aspase）后裂解。

图 1.死亡受体信号传导。

（A）表达痘病毒CrmA的MCF7乳腺癌细胞在TNF或激动剂抗Fas抗体的致命挑战中存活。转载自（1）。（B）由Fas配体（Fas-L）组装的DISC由死亡受体Fas，适配器分子FADD和pro-caspase-8组成。DISC通过DD和DED之间的同型相互作用来巩固。DISC内半胱天冬酶-8的激活引起p18和p10催化亚基（以黄色突出显示），它们通过切割和激活下游效应半胱天冬酶（包括YAMA/半胱天冬酶-3）来传递死亡信号。重要底物的切割导致细胞死亡。

继续下一个谜团：死亡受体是如何激活半胱天冬酶的？在1990年代初期，研究人员认为受体通过充当离子通道或通过改变磷酸化 - 去磷酸化事件来发出信号。我实验室的两位才华横溢的研究人员Arul Chinnayan和Marta Muzio很快发现了一种全新的受体信号机制。Arul在1995年发现，Goeddel早些时候定义的DD代表同型蛋白质 - 蛋白质相互作用基序。换句话说，一种蛋白质中的DD可以与另一种蛋白质中的DD结合，从而将蛋白质连接在一起。Arul表明，Fas中的DD招募了Fas相关的DD（FADD）蛋白。他的第二个发现是FAD有第二个相关的基序，他称之为死亡效应域（DED）。FAD中的DD和DED基序对于传递激活半胱天冬酶-3的凋亡信号至关重要（3）。

Marta的任务是鉴定与FAD中DED相互作用的蛋白质。Marta与Matthias Mann和Krammer的实验室合作，在1996年表明FADD DED与pro-caspase-8结合，后者是蛋白酶的非活性形式。Pro-caspase-8在其pro-domain中有两个DEV。该复合体由Fas，FAD和pro-caspase-8组成，他们称之为致死信号复合物（DISC）（4）。大卫·瓦拉赫也得出了类似的结论（5）。

后来，我们与Guy Salvesen合作，我们证明了pro-caspase-8是由诱导接近激活的。DISC中半胱天冬酶原-8的二聚化和自动处理释放活性半胱天冬酶-8，然后切割并激活半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7。这种半胱天冬酶级联释放出陡峭的蛋白水解活性，以惊人的整洁和可重复的方式分解细胞（图1B）。

我们对我们意想不到的成功感到鼓舞和振奋。我们已经发现了我们对死亡受体如何发出信号的理解存在重大差距，正面解决了这个问题，并利用我们的兴奋来吸引其他科学家合作。当我进行另一个重大的职业转变时，我会依靠这些见解，从学术界转向工业界。1997年，我担任基因泰克公司分子肿瘤学主任，我的团队发现细胞可以使用另一种不同于细胞凋亡的途径死亡。

二、炎性小体

多年来，我一直参与了许多令人兴奋的发现，但我认为2011年与Nobuhiko Kayagaki一起发现的非规范炎症小体是我对分子生物学的另一个主要贡献。2002年，已故的Jurg Tschopp创造了“炎症小体”一词来描述当微生物或内源性损伤破坏细胞质区室时激活半胱天冬酶-1的细胞内复合物。该信号复合物由传感器和适配器组成，它们共同形成激活pro-caspase-1的平台（图2A）。炎性小体组装由源自入侵微生物的病原体关联分子模式 （PAMP） 或作为危险相关分子模式 （DAMP） 的内源性损伤（如尿酸晶体）触发。炎症小体内半胱天冬酶原-1的激活，再次通过诱导的接近机制，对先天免疫至关重要的两个后果。半胱天冬酶-1切割IL-1β和IL-18的未成熟形式以产生活性细胞因子，同时，半胱天冬酶-1切割gasdermin D（GSDMD）以释放通过穿孔膜杀死细胞的孔形成片段。这种炎症形式的细胞死亡被称为焦亡。结果，缺乏分泌信号序列的成熟IL-1β和IL-18可以通过穿孔细胞膜排出，从而向邻近细胞发出炎症警报。

图 2.典型炎症小体信号传导。

（A）典型炎症小体由细胞内传感器，适配器ASC和半胱天冬酶-1组成。原型传感器NLRP3由破坏细胞质区室的试剂激活，包括三磷酸腺苷、溶酶细胞制剂、晶体和蛋白质聚集体。NLRP3与ASC结合，ASC又与pro-caspase-1酶原（闭合剪刀）结合。PYRIN和CARD结构域是将复合物结合在一起的同型蛋白质-蛋白质相互作用基序。活性半胱天冬酶-1（开放式剪刀）将原-IL-1β和原-IL-18分别切割成活性IL-1β和IL-18。促炎性潮湿的IL-1β，IL-18，IL-1α和HMGB1都缺乏信号肽，但通过焦亡（一种细胞死亡的裂解形式）从细胞中释放出来。（B）Fas DISC和NLRP3炎性小体具有相似的结构;它们各自使用相关的蛋白质 - 蛋白质相互作用基序将传感器，适配器和半胱天冬酶结合在一起。

组装炎症小体的传感器识别特定的侮辱。例如，NLRC4传感器通过检测相关的PAMP（包括鞭毛蛋白）来检测革兰氏阴性细胞内病原体，例如沙门氏菌和志贺氏菌。另一种传感器NLPR3对炎症介质（如尿酸或离子载体尼日利亚菌素）做出反应。每个传感器都有一个蛋白质 - 蛋白质相互作用基序，其形式为半胱天冬酶活化和募集结构域（CARD）或Pyrin结构域。CARD和Pyrin域在结构上都与前面讨论的DD和DED相关。诸如NLRP3之类的Pyrin域传感器通过适配器ASC接合含有CARD的pro-caspase-1，ASC具有Pyrin域和CARD。因此，DISC和炎性小体具有共同的结构（传感器-适配器-半胱天冬酶），并通过相关的相互作用基序（图2B）巩固。

三、非规范性炎症小体的发现

非规范性炎症小体的发现始于呜咽而不是爆炸。2010年，我们测试了各种PAMP，以确定它们是否激活了小鼠骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）中的炎症小体。我们注意到霍乱毒素亚基B（CTB）激活了C57BL / 6小鼠细胞中的炎症小体，但未激活129 / SvEv小鼠中的炎症小体（6）。这一发现很奇怪，但也许129 / SvEv小鼠缺乏已知的炎症小体成分。然而，奇怪的是，129 / SvEv BMDMs很好地激活了炎症小体，以响应其他PAMP或DAMP。事实上，129 / SvEv细胞表达了所有已知的传感器，适配器ASC和半胱天冬酶-1。我们得出的结论是，129/SvEv细胞一定缺乏CTB的特异性传感器。

出于好奇，我们扩大了搜索范围，却发现129 / Sv小鼠缺乏半胱天冬酶-11，这是一种与半胱天冬酶-1具有实质性同源性的半胱天冬酶。129/Sv Caspase-11基因的剪接突变改变了阅读框，导致无义介导的Caspase-11转录本的衰变。这一发现表明炎症小体需要半胱天冬酶-11来应对CTB。我们使用缺乏半胱天冬酶-1或半胱天冬酶-11的小鼠来确认这种意外的依赖性。然而，我们很快意识到，在数百种出版物中使用的原始Caspase-1敲除小鼠实际上缺乏caspase-1和caspase-11。在Caspase-11缺陷的129 / Sv胚胎干细胞中产生，Caspase-1敲除等位基因紧邻突变的Caspase-11，并且两个等位基因不容易分离。因此，使用这些小鼠得出的所有结论都需要重新评估。所有报告的表型都可能是由于半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-11或两者的缺乏。我在意大利举行的2011年拓领会议上向震惊的听众介绍了这些发现。许多人想知道这个领域被这种疏忽误导了多远。

我们急忙在C11BL / 57小鼠品系中产生半胱天冬酶-6敲除，并用Caspase-11转基因重组半胱天冬酶-1-11双敲除中的表达。使用这些小鼠的结果是明确的。半胱天冬酶-11对于革兰氏阴性肠病原体（包括大肠杆菌和啮齿枸橼酸杆菌）的炎症小体参与至关重要。我们将这种新的半胱天冬酶-11依赖性信号传导管道命名为非规范炎症小体途径（11）。

现在有一个问题迫在眉睫：革兰氏阴性生物的哪些成分触发了非规范途径？我们很高兴能解决这个临床相关的问题。与革兰氏阴性败血症相关的失控性全身炎症每年导致数百万人死亡。我们手头用于参与非规范途径的分子工具是CTB。我们希望用它来揭示所有革兰氏阴性细菌共有的精确触发因素，但事实证明这是一项艰巨、持久和最令人沮丧的任务。炎症小体测定的复杂性使我们受挫。为了获得强大的炎症小体活化，BMDM必须首先启动炎症刺激，该刺激上调许多相关成分的表达，包括半胱天冬酶-11和IL-1β。启动通常使用Toll样受体（TLR）激动剂完成。令人困惑的是，我们发现当我们用TLR4激动剂脂多糖（LPS）启动BMDM时，CTB强烈地激活了炎症小体，但当使用TLR2激动剂Pam3CSK4时则没有。相比之下，两种启动方法都支持其他刺激的炎症小体激活。更复杂的是，仅用特定的LPS血清型O111：B4启动才能使CTB激活半胱天冬酶-11。

我们努力理解数据。一个重要的线索是CTB与LPS血清型O111：B4的高可变O抗原多糖结合，但不与具有不同O抗原的LPS血清型结合。我们想知道通常将CTA亚基递送到细胞中的CTB是否仅仅是将从启动步骤传递到细胞质中的LPS O111：B4的信使（图3A）。我们意识到，LPS，无论血清型如何，只要它可以进入细胞质，就可能能够触发非规范途径。事实上，通过转染引入的LPS克服了血清型限制（图3B）。我们得出结论，LPS是革兰氏阴性生物的常见组成部分，是非规范途径的触发因素。其他转染研究表明，LPS的保守脂质A部分对于激活半胱天冬酶-11至关重要，而高可变O抗原部分是可有可无的（7）。同时，Edward Miao的实验室还表明，胞质LPS激活半胱天冬酶-11（8）。

图 3.非规范性炎症小体。

（A）CTB与GM1质膜神经节糖结合，将CTA（左）或LPS血清型O111：B4（右）递送到细胞质中。CTB与LPS血清型O111：B4的超发散O特异性多糖链结合。（B）LPS血清型O-A（包括O111：B4）与CTB结合以进入细胞质。相比之下，LPS血清型O-B不与CTB结合，因此无法获得访问。然而，这两种血清型都可以通过转染引入。（C）半胱天冬酶-1或半胱天冬酶-11切割GSDMD，释放N末端p30片段，该片段寡聚成约20nm孔。GSDMD孔塌陷电化学梯度并将包括IL-1β和IL-18在内的DAMPs释放到细胞外环境中。

革兰氏阴性病原体含有过多的PAMP。因此，我们需要确定激活半胱天冬酶-11的只是LPS，而不是额外的PAMP。为了明确解决这个问题，我们在LPS合成的倒数第二步中使用了一种缺乏的大肠杆菌菌株。令人欣慰的是，这种菌株未能激活半胱天冬酶-11。我们已经证明，非规范途径专用于检测细胞内LPS（7）。这种非规范途径不需要已知的LPS受体TLR4，因为非规范炎症小体在Tlr4敲除小鼠中功能齐全。2011年诺贝尔奖因发现TLR4作为LPS受体而获得（9），但我们对半胱天冬酶-11的发现表明，还有另一种具有独特功能的LPS传感器。

结语

我们发现非规范途径作为胞质LPS传感器引发了淘金热，导致我们的实验室和其他人迅速取得进展。值得注意的是，这包括发现GSDMD作为半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11的下游底物（10，11）。

令人兴奋的发现一直持续到今天。2021 年，我们发现膜破裂后的细胞裂解并不像生物学入门教科书所相信的那样是由渗透力介导的被动事件，而是由膜蛋白 NINJ1 主动加速 （12）。

在我的职业生涯中，除了坚持不懈的回报之外，我还学到了什么？选择一个重要的问题，让数据说话，做实验来挑战你先入为主的观念。