摘要：离子霉素（Ionomycin，AbMole，M3621，CAS No.：56092-81-0） 是源自 Streptomyces conglobatus 的天然聚醚类钙离子载体，可跨膜转运 Ca2⁺/Mg2⁺ 等二价阳离子，使胞内 Ca2⁺ 浓度快速升高，是钙信号研究的经典化学工具。凭借其可控、可逆、快速的钙动员特性，离子霉素与佛波酯（PMA，Phorbol 12-myristate 13-acetate）联用构成激活 T 细胞的经典组合，广泛用于T细胞活化、细胞因子表达、中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）及钙依赖性细胞死亡研究。本文梳理离子霉素的分子机制、细胞实验与动物来源细胞的应用方案。

一、Ionomycin的分子作用机制

离子霉素（Ionomycin，AbMole，M3621）是二羧酸聚醚类离子载体，疏水空腔能可逆螯合二价阳离子并携带其跨膜转运，对 Ca²⁺ 的亲和力高于 Mg²⁺。其作用不依赖膜受体与通道，可在数秒至数分钟内使胞质 Ca²⁺ 浓度升高一个数量级以上。升高的 Ca²⁺ 激活钙调蛋白与钙调磷酸酶（Calcineurin），促使 NFAT 家族转录因子去磷酸化并入核，与 AP-1 协同结合 IL-2 启动子，驱动细胞因子转录。离子霉素（Ionomycin）与佛波酯 PMA（激活 PKC-NF-κB 通路）联用时，两条 TCR （T细胞受体）下游通路被同时激活，产生远超单用的协同效应，从而绕过 TCR 上游信号实现T细胞的激活和细胞因子的表达。此外，在流式胞内细胞因子检测实验中，离子霉素（Ionomycin，AbMole，M3621）和佛波酯（PMA，Phorbol 12-myristate 13）构成的刺激体系还需要搭配布雷菲德菌素 A（Brefeldin A，AbMole，M2294）或莫能菌素（Monensin，AbMole，M6991）使用，Brefeldin A和Monensin能阻断细胞因子向外分泌，让细胞因子在胞内累积，方便检测。除了免疫细胞的相关研究，离子霉素（Ionomycin）持续高浓度处理还能通过内质网-线粒体钙转移导致线粒体钙超载，诱发氧化应激与凋亡，因此也是研究钙依赖性细胞死亡的工具。

二、Ionomycin在细胞层面研究中的应用

在 Jurkat T 细胞中，PMA（20 ng/mL）联合离子霉素（1 μg/mL）处理 15~60 min 即可检测 IKK/NF-κB 激活与 NFATc2 去磷酸化，8~10 h 达到 IL-2 转录峰值，24 h 可检测到新生 IL-2 分泌；单用离子霉素（Ionomycin，AbMole，M3621）主要激活 NFAT（活化 T 细胞核因子，该转录因子可以启动 IL-2 等细胞因子的表达）通路，单用 PMA 主要激活 NF-κB/AP-1通路。离子霉素（Ionomycin，AbMole，M3621）的典型应用包括：T 细胞功能与耗竭表型研究、胞内细胞因子流式检测的阳性对照、Fluo-4/Fura-2 钙成像工具、B 细胞钙依赖性凋亡模型、中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）诱导，以及肥大细胞脱颗粒与膜修复机制研究。在 T 细胞功能与耗竭表型研究中，常采用小鼠肿瘤浸润原代 CD8⁺T 细胞或人外周血 CD8⁺T 细胞，联合 50 ng/mL PMA 与 1 μM 离子霉素共同刺激 4–5 h，并于刺激末期加入Brefeldin A，耗竭 CD8⁺T 细胞经该方案重刺激后，IFN‑γ 阳性细胞比例明显低于效应 T 细胞，以此评估 T 细胞的功能耗竭状态。离子霉素（Ionomycin，AbMole，M3621）还能作为胞内细胞因子流式检测的阳性对照，例如选用 PBMC 或小鼠脾脏原代淋巴细胞，使用 20–50 ng/mL PMA 搭配 0.5–1 μM 离子霉素，同时添加 5 μg/mL Brefeldin A，37 ℃共孵育 4–6 h。该处理能够显著上调 T 细胞 IFN‑γ、TNF‑α、IL‑2 等细胞因子表达，代表 T 细胞因子分泌能力上限，用于和抗原特异性刺激组对比，评估抗原特异性免疫应答。离子霉素（Ionomycin，AbMole，M3621）还能用于诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）相关实验，研究通常使用外周血原代中性粒细胞，并用5 μM 的离子霉素孵育 90–180 min，该通路为非 NOX 依赖型 NETosis，经 SYTOX Green 染色可观察胞外 DNA 网状结构，Cit‑H3 表达上调，上清游离 DNA 含量明显升高，多用于自身免疫相关 NETs 调控化合物筛选。

三、Ionomycin相关细胞实验（文献参考举例）

该方案适配 T 细胞活化信号、钙流与细胞因子检测。

细胞系：T淋巴细胞系Jurkat E6-1

检测指标与方法：Fluo-4/AM 单细胞钙成像；NF-κB 与 NFAT/AP-1 双荧光素酶报告基因；上清 IL-2 ELISA；Western blot 检测磷酸化 p65、NFATc2 去磷酸化迁移条带；胞内细胞因子流式染色（阳性对照体系）。

给药浓度：离子霉素 0.5~1 μg/mL（与 PMA 20 ng/mL 联用）；钙成像 1~10 μM

处理时长：信号检测 15~60 min；转录活性检测 8~10 h；细胞因子检测 24 h

参考文献：Chatila T, et al. Mechanisms of T cell activation by the calcium ionophore ionomycin. Journal of Immunology, 1989, 143(4): 1283-1289.

*注：上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献调整。

四、Ionomycin相关动物实验（文献参考举例）

该方案适用于小鼠来源原代 T 细胞的功能与信号检测（离体刺激）。

动物模型：C57BL/6 小鼠，脾脏来源原代 T 细胞

实验方法：无菌分离脾脏，红细胞裂解后计数脾细胞；PMA 20 ng/mL 联合离子霉素 1 μg/mL 刺激 4~6 h（刺激 1 h 后加入 Brefeldin A 或莫能菌素阻断胞内转运）；流式细胞术检测 CD4+/CD8+ T 细胞 IFN-γ、IL-2、TNF-α 胞内表达及 pERK、pS6 等磷酸化信号。

参考文献：Crawford T Q, et al. Concomitant evaluation of PMA+ionomycin-induced kinase phosphorylation and cytokine production in T cell subsets by flow cytometry. Cytometry Part A, 2014, 85(3): 268-276.

*注：上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献调整。

总结

综上，离子霉素（Ionomycin，AbMole，M3621）以快速、可控、可逆的钙动员能力，成为钙信号与免疫细胞活化研究中重要的化学工具。无论是解析 TCR 信号整合、建立 NETs 与钙依赖性死亡模型，还是作为T细胞功能检测的阳性刺激，Ionomycin都有着重要的应用。

*本文所述均为科研试剂，仅供科学研究参考*

参考文献

[1] Liu C, Hermann T E. Characterization of ionomycin as a calcium ionophore. Journal of Biological Chemistry, 1978, 253(17): 5892-5894.

[2] Chatila T, et al. Mechanisms of T cell activation by the calcium ionophore ionomycin. Journal of Immunology, 1989, 143(4): 1283-1289.

[3] Crawford T Q, et al. Concomitant evaluation of PMA+ionomycin-induced kinase phosphorylation and cytokine production in T cell subsets by flow cytometry. Cytometry Part A, 2014, 85(3): 268-276.

[4] Fuchs T A, et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology, 2007, 176(2): 231-241.

[5] Pinton P, et al. Calcium and apoptosis: ER-mitochondria Ca2+ transfer in the control of apoptosis. Oncogene, 2008, 27(50): 6407-6418.

支持单位：