作者：Fengjuan Yang, Wanqi Li, Wei Ye, Peng Hu, Yinhua Lu, Weihong Jiang, Yang Gu*

01 论文信息

论文信息

Fengjuan Yang, Wanqi Li, Wei Ye, Peng Hu, Yinhua Lu, Weihong Jiang and Yang Gu. Stepwise Engineering of Clostridium ljungdahlii for Efficient Ethanol Production from Single-Carbon Gases[J].Green Carbon, 2025.

论文网址

https://doi.org/10.1016/j.greenca.2025.06.003

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Stepwise engineering of Clostridium ljungdahlii for efficient ethanol production from single-carbon gases

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Green Carbon文章 | 上海理工大学顾阳教授：工程化永达尔梭菌实现一碳气体高效合成乙醇

02 背景简介

以二氧化碳为代表的一碳气体已成为替代传统淀粉/糖基生物制造原料的重要选择项，尤其适用于生物发酵合成燃料和大宗化学品。近年来该领域最显著进展和突破是利用食气梭菌发酵钢铁/煤化工企业的含碳尾气（CO/CO₂）实现生物燃料——乙醇的大规模工业生产，从而开辟了一条可规避与粮食和土地资源竞争的新型生物乙醇生产路径。然而，目前应用于气体发酵的自养型梭菌主要依赖于自然选育或诱变筛选结合实验室适应性进化所产生，在遗传性状的稳定性以及可控性方面仍存在一定不足，开发人工菌株以实现气体发酵的乙醇高产、稳产是需要关注的重要课题。但由于食气梭菌分子遗传改造相对困难，限制了高效工程菌株的设计和开发。

来自上海理工大学、中国科学院植物生理生态研究所以及上海吉态来博生物技术研究有限公司的联合研究团队于Green Carbon发表题为“Stepwise engineering of Clostridium ljungdahlii for efficient ethanol production from single-carbon gases”研究论文。该研究团队基于前期建立的高效梭菌厌氧分子技术平台，对食气永达尔梭菌进行了系统代谢工程改造，基于三管齐下的代谢策略：强化乙醇合成途径、改善乙酸同化能力、减少2,3-丁二醇副产物生成，实现工程菌株在实验室条件下高效利用合成气（CO-CO₂-H₂）生产乙醇（102小时内产量30.1 g/L）。研究成果为开发高性能气体发酵梭菌菌株奠定了基础，相关代谢工程策略也可应用于现有工业菌株以进一步提升乙醇合成能力。

03 文章简介

乙醇合成途径的强化

在永达尔梭菌中，有两个双功能乙醛/乙醇脱氢酶（AdhE1 和 AdhE2）可催化乙醛脱氢合成乙醇。研究团队利用强启动子P_pta驱动这两个酶基因的表达，得到了工程菌株Clj-EtOH01和Clj-EtOH02，提高了合成气发酵条件下的乙醇合成量。为了进一步增强前体——乙醛的供给，研究团队在Clj-EtOH01和Clj-EtOH02菌株中又分别过表达了催化转化乙酰辅酶为乙醛的脱氢酶基因。所获得的两株工程菌株Clj-EtOH03和Clj-EtOH04的乙醇合成能力均得到进一步增加，其中的Clj-EtOH03 显示出更强的乙醇合成能力。

图1. 乙醇合成途径的强化

副产物乙酸回用途径的强化

永达尔梭菌具有较强的乙酸合成能力，从而削弱了流向乙醇合成的碳代谢流。而单纯阻断乙酸合成又会严重影响细胞内的ATP合成，继而造成菌株生长缺陷。因此，需要通过强化乙酸回用途径基因的表达来解决这个问题。研究团队测试和比较了多个潜在的催化乙酸回用的功能基因，包括催化乙酸合成乙酰辅酶A的acs（编码酰基辅酶A合成酶）、来源于大肠杆菌的fadKM1/M2基因（编码短链酰基辅酶 A 合成酶）以及催化乙酸合成乙醛的aor1/2基因（编码铁氧还蛋白氧化还原酶）。结果显示，过量表达aor1和aor2基因能够促进永达尔梭菌的乙酸消耗和乙醇合成。因此，这两个关键酸回用基因被引入上述工程菌株Clj-EtOH03中过量表达，获得的Clj-EtOH05和Clj-EtOH06菌株的乙醇合成量继续得到提升，分别达到Clj-EtOH03菌株的6.1和5.1倍。

图2. 菌株乙酸回用能力的改善

抑制副产物2,3-丁二醇途径促进乙醇合成

2,3-丁二醇和乳酸也是永达尔梭菌在气体发酵过程中会产生的两种副产物。因此，这两种产物合成途径的关键基因也被逐一删除，包括乳酸脱氢酶基因ldhA、乙酰乳酸脱羧酶基因alsD和3个丁二醇脱氢酶脱氢酶基因bdh。研究团队在Clj-EtOH05菌株中同时敲除了三个bdh基因得到了重组菌株Clj-EtOH07，单独敲除了alsD基因得到了重组菌株Clj-EtOH08。气体发酵结果显示，虽然Clj-EtOH08菌株与对照菌株（Clj-EtOH05）相比乙醇产量没有显著差异，但Clj-EtOH07菌株与对照菌株相比乙醇合成量增加了20%，乙酸合成量减少了18%。

图3. 2,3-丁二醇途径对乙醇合成的促进作用

气体发酵优化展示工程菌乙醇合成潜力

为了充分发掘工程菌株Clj-EtOH07的气体发酵合成乙醇的潜力，该菌株被用于连续供气发酵实验。在发酵过程中，氨水被用于调控pH值使其保持在5.0，并流加营养盐。工程菌Clj-EtOH07的生物量逐渐增加，在102小时达到最高水平（OD₆₀₀ = 17.2）。此时，乙醇产量为30.1 g/L，以及少量的副产物乙酸。

图4. 工程菌的连续供气发酵合成乙醇

总结与展望

本研究通过代谢工程改造成功构建了一株高效合成乙醇的工程化食气梭菌，可利用合成气实现高选择性的乙醇生产。研究结果不仅为定向改造食气梭菌提供了创新性策略，也可为现有工业食气梭菌的性能优化提供重要参考。

04 作者简介

顾阳 教授

顾阳，博士，上海理工大学教授。长期从事厌氧细菌的代谢调控、代谢工程以及合成生物学研究。研究方向包括：(1) 难操作厌氧微生物合成生物学使能技术开发。针对工业及健康相关的厌氧微生物遗传改造难这一问题，突破技术瓶颈，开发共性基因组编辑工具及基因表达调控技术。(2) 厌氧微生物代谢调控研究。研究厌氧微生物碳同化与产物合成的代谢路径及调控机制，阐明其代谢与环境间相互作用。(3) 一碳资源的生物定向转化。设计与构建一碳微生物细胞工厂，高效转化CO₂等一碳气体合成高值化学品。

05 Green Carbon

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