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       本文提出了一种基于“胺-活化酯”反应性聚合物的新型芯片表面化学处理方案，通过点击化学策略在聚五氟苯基丙烯酸酯（PPFPA）链上分步引入功能基团，首先将含叠氮小分子胺链段与PPFPA进行酰胺化反应，利用叠氮基团的反应活性实现探针定向固定，可以锚定DBCO修饰的DNA探针；随后以亲水性小分子胺链段替换剩余活性位点，增强亲水性，消除静电干扰并优化生物相容性。该设计突破性地将传统7步修饰流程简化为2步反应，生产周期缩短，同时通过聚合物分子量调控，在保持探针结合密度的基础上，将DNA固定效率提升90% (达1200探针/μm²)，芯片簇密度提升至0.54/μm²，测序准确率(RawQ30)达87.8%，且材料成本降低40%。实验验证表明，该PPFPA平台不仅解决了传统聚合物“高活性位点密度与高稳定性难以兼得”的性能悖论，更通过精准的功能基团设计为测序芯片表面工程提供了可定制化的新材料。

基因测序作为精准医疗的核心技术，其芯片性能直接影响检测准确率与成本。传统测序芯片多采用聚丙烯酰胺材料，但该材料存在显著瓶颈：合成需多步共聚反应，工艺复杂；表面修饰需5-7道工序（如等离子体活化、化学接枝等），耗时长达72小时；且因表面活性位点不足，DNA探针固定密度仅约780探针/μm²，测序准确率（RawQ30）受限在85%左右，单样本检测成本超20美元。这些限制导致基因测序难以大规模普及，尤其在临床筛查、肿瘤早诊等场景中，探针固定效率不足直接制约检测灵敏度与通量。因此，开发高性能、易修饰的新型芯片材料成为突破技术壁垒的关键需求。

基于上述背景，东华大学先进低维材料中心刘浩研究员课题组开发了一种胺反应性聚合物平台（PPFPA），用于下一代基因测序芯片的高效DNA固定。如图1所示，通过两步修饰策略，首先将叠氮基团通过胺-活化酯的酰胺化反应引入，随后用不同种类的小分子胺封闭剩余活性位点以增加聚合物的亲水性。

文章首先展示了小分子胺与PPFPA聚合物的聚合后修饰与芯片表面修饰过程（图1）。图（a）左侧为聚五氟苯基丙烯酸酯PPFPA主链结构。本文设计了两种类型的含叠氮基胺类物质，NH₂-C₅-N₃和NH₂-EG₃-N₃（表示为单体1，见图1a），与一小部分PFP活性酯反应，以固定DBCO-P7LG和DBCO-P5LU引物。因此，应用了四种不同电荷状态的胺类物质（表示为单体2，见图1a）：异丙醇胺（IPA）、甘氨酸（Gly）、3-氨基丙酰胺（APA）和氨水溶液（AS），以消耗剩余的PFP酯基团，引入多种亲水性官能团和电荷状态。所得具有不同单体1和单体2组合的聚合物被应用于NGS芯片的表面修饰。

_{图1 用于基因测序芯片表面修饰的聚合物制备示意图: (a)小分子胺单体-1与单体-2先后对PPFPA平台进行聚合后修饰转化; (b)将表面修饰聚合物共价锚定到修饰有炔基的测序芯片表面。}

文章接着对单体PFPA和聚合物PPFPA的化学结构进行了系统性表征（图2）。本文通过调节单体与引发剂的比例来制备不同分子量的PPFPA。如图2(a)和2(b)所示，PPFPA的¹H-NMR谱图在3.10、2.48和2.10 ppm处呈现几个宽峰，而PPFPA的¹⁹F-NMR谱图在与PFPA相同的位置显示出三个主峰，但峰形更宽，这证实了PPFPA的成功合成。在图2(c)的FTIR光谱图中，1780、1250和1500 cm⁻¹处的峰归属于聚合物中的PFP基团。SEC分析也证实了成功合成，如图2(d)所示，保留时间从8.51分钟减少到7.03分钟，显示出分子量增加的明显趋势。SEC曲线呈现对称的单分散峰，反映了适中的分子量分散度（D）和均匀的分子量分布，这对于一致的材料性能和可重复性至关重要。

图2 PPFPA聚合物的化学表征：(a) ¹H-NMR谱图，(b) ¹⁹F-NMR谱图，(c) FTIR谱图和(d) SEC谱图。

文章接下来将两种常见的单链DNA（ssDNA）片段DBCO-P7LG和DBCO-P5LU的水溶液通入芯片的微流控通道中，来比较DNA引物的固定效率。如图3所示，它们通过表面修饰聚合物的叠氮基团与ssDNA片段的DBCO基团之间的“点击反应”固定在芯片表面。然后，将带有荧光团的互补ssDNA（P7-CY3和P5-CY3）溶液通入芯片通道，它们可以特异性地与已固定的P7LG和P5LU配对。CY3是一种花青荧光染料，当被550 nm的绿光激光激发时，会发射橙红色光（570 nm）。因此，可以通过检测配对的P5-CY3和P7-CY3的荧光强度来表征表面修饰聚合物的固定效率。荧光强度必须达到最低限度才能应用于后续的基因测序测试。否则，如果荧光强度不足，测序过程将被终止。

图3 通过荧光强度测试评估ssDNA引物固定效率的机制示意图。

图4. (a) 由不同聚合物修饰的四通道测序芯片的真实图像和荧光测试图像，显示了各通道的表面修饰聚合物、荧光亮度和强度; (b) 芯片通道2-4的RawQ30值和 (c) 接枝密度值，反映了它们的基因测序性能。

文章通过四通道测序芯片的表面修饰聚合物对比实验（图4）（通道1：负对照P2(N₃-COOH)-C₅；通道2：实验组P4(N₃-CONH₂)-C₅；通道3：实验组P1(N₃-OH)-C₅；通道4：正对照商业聚合物），荧光强度测试显示中性羟基修饰的P1(N₃-OH)-C₅（通道3）达到12,239 cps，接近商业对照组性能，而带负电荷的P2组（通道1）仅203 cps，证实电荷状态对DNA固定的关键影响。在测序性能方面，P1(N₃-OH)-C₅的RawQ30值达87.8%（远超80%质控线），DNA簇密度0.540 μm⁻²（超阈值0.300 μm⁻²），其分子量优势使性能甚至略优于商业聚合物；而化学组成与商业产品相同的P4(N₃-CONH₂)-C₅（通道2）因分子量不足导致RawQ30未达标（<80%）且簇密度不合格，凸显高分子量对表面修饰效果的决定性作用。这些数据证明：中性羟基修饰与高分子量结合的P1(N₃-OH)-C₅在DNA固定效率、测序准确性和信号密度上均超越商业基准，为NGS芯片表面工程提供了创新解决方案。

本工作题为“Amine-reactive Polymer Platform for Engineering Surface Modification of Next-generation Sequencing Chips”为题发表在Chinese Journal of Polymer Science上，田伟博士研究生是该论文的第一作者，刘浩研究员、李慧研究员、金跃康博士后为通讯作者。

Citation:

Tian, W.; Wang, X. Y.; Feng, D. W.; Li, X. Q.; Jin, Y. K.; Li, H.; Liu, H. Amine-reactive polymer platform for engineering surface modification ofnext-generation sequencing chips. 

Chinese J. Polym. Sci.  2025

DOI: 10.1007/s10118-025-3413-8