蛋白−蛋白偶联物在生物技术和生物制药研究领域的发展中发挥着重要的作用，比如治疗性双特异性抗体、生物成像剂和双功能酶[1−4]。这些偶联物通常来源于基因融合的重组表达蛋白[5,6]。虽然融合蛋白比较常用，但仍具有一定的局限性，包括结构域的不正确折叠，稳定性差，仅能N-C融合等等[5,6]。然而，翻译后蛋白质-蛋白质偶联策略能够拓展多样性，例如N-N，C-C偶联等[7]，比较常用的方法是通过带有功能性反应基团的连接子与蛋白反应。

　　马来酰亚胺与半胱氨酸巯基的反应极为常用，但可能发生逆迈克尔加成以及与内源硫醇发生硫醇交换反应[8,9,10,11](图1)。此文献中，Michele组描述了一种同源双功能连接策略，基于半胱氨酸与全氟芳香族试剂的芳基化，通过亲核取代产生稳定的S−C(sp2)键。“π-钳”序列(Phe-Cys-Pro-Phe)[12,13]增强了半胱氨酸与全氟芳香族化合物的反应，已被应用于ADCs和PROTAC开发[12,14,15]。Michele组通过“π-钳”序列和位点特异性偶联，使用双五氟苯磺酰胺官能化的连接子(L1/L2)制备得到了更加稳定连接的蛋白质-蛋白质偶联物(图1)。

图1:左为二聚体合成流程；右为马来酰胺和五氟苯磺酰胺连接子比较

　　事实上，这种连接策略针对SARS-CoV-2刺突蛋白蛋白受体结合域(RBD)上两个不同表位计算设计的抗体((desAbs)二聚体，命名为C1及C2(图2)，并将其偶联制备为同/异二聚体，有利于增加其大小，提高结合亲和力。因此作者以此为模型进行实验。

图2：抗体C1，C2

　　首先，作者将C1进行工程化，在序列中引入半胱氨酸。C1-DCE中含有D-C-E，C1-π中含有“π-钳”序列(F-C-P-F)。实验发现，C1-DCE的反应性不足以转化为完全修饰的单体，但C1-π反应性明显更高，在温和条件下3小时内完全转化为C1-L1(图3)。除此之外，制备的C1-π突变体C1-A-C-P-A对照的实验结果也表明，“π-钳”序列是增加反应性的来源，对于二聚化制备必不可少。

　　因此作者在连接子L1与C1-π孵育24小时后，制备得到了同二聚体C1C1-L1。类似的，也通过连接子L2及C2-π制备了不同的同二聚体。异二聚体的制备则是通过将纯化后的C1-L1与C2-π孵育。纯化后的偶联物经过SDS-PAGE的表征及二级结构，热变性温度的测试，表明其结构未受到影响，且具有稳定性。

图3. 同二聚体/异二聚体制备及生物物理性质表征

　　接下来，作者探究了异二聚体制备的第二步反应是否对π序列的半胱氨酸具有选择性。由此，作者设计了C1-π-DCE，在Tev酶切割序列的上游与下游分别含有D-C-E序列与“π-钳”序列(F-C-P-F)，即两个不同的半胱氨酸(图4)。作者制备了C1-π/C1-π-DCE-L2异二聚体，并使用Alexa-647荧光染料与仍暴露的半胱氨酸反应，随后使用Tev酶切。实验结果如图4bc。Tev酶切割后二聚体未解偶联，并且荧光分子并未与C1-π-DCE一同被切下，说明反应按照图4a所示发生，偶联步骤对π序列的半胱氨酸具有特异型。

图4.C1-π/C1-π-DCE-L2异二聚体制备及表征

　　最后，作者评估了二聚体对抗体KD的影响。微尺度热泳测量的结果表明，二聚体相对于组成的单体KD值提高10-60倍。这是由于“强制邻近效应”导致偶联物解离变慢。不同的二聚体均具有相似的KD值，说明他们与RBD的结合模式相似。

　　总而言之，五氟苯磺酰胺连接子与基于“π-钳”序列的半胱氨酸制备得到了化学位点特异性的蛋白的同二聚体及异二聚体，这种方法有望应用于制备更多的双特异性ADCs，也有可能成为有效的治疗药物。

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