Section.01

真不能盲选 siRNA 吗？

结论先行：

siRNA 是体外短期敲低的有效手段，但无法一劳永逸。

病毒入侵并复制时，会产生独特的双链 RNA (dsRNA) 中间产物，dsRNA 被宿主细胞内的 Dicer 酶切割成小干扰 RNA (siRNA)，这些 siRNA 被整合到 RNA 诱导的沉默复合物 (RISC) 复合物中，其中两条链相互分离。含有引导链或反义链的 RISC 会寻找并结合互补的病毒信使 RNA (mRNA)。随后，RISC 中的 Argonaute 酶 (负责降解 mRNA 的酶) 将这些 mRNA 序列切割降解，导致 mRNA 表达下调，从而使病毒无法利用细胞工厂合成自身蛋白而失活 (图 1)。

图 1. RNA 干扰的细胞机制^[1]。

1998 年，科学家 Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello 在研究线虫时发现，只需人为向细胞内注射一小段人工合成的双链 RNA (dsRNA)，就能主动诱发该机制。这段 dsRNA 的序列只要与目标基因的 mRNA 互补，就能精准指挥细胞内的切割机器（Dicer 和 RISC 复合体）去定点清除该 mRNA。该发现也荣获 2006 年诺贝尔奖^[2]。

但早期尝试发现哺乳动物细胞对长链 dsRNA 会引发细胞强烈的抗病毒干扰素反应。直至 2001 年，科研团队发现：如果直接向哺乳动物细胞输入已经修剪好的、只有 21-23 个碱基对的siRNA，就能绕过细胞的免疫警报，成功实现单基因的精准敲低。由此开启了 RNAi 的广泛应用时代^[3]。

作为一种高效的基因敲低工具，siRNA 拥有诸多优点：特异性高，起效快，效率高，设计周期短，操作门槛低。

如今，科研人员可以直接在电脑上设计针对任何已知基因的 siRNA 序列，然后通过化学合成定制试剂，直接用转染试剂（如脂质体）包裹送入细胞。siRNA 设计和转染详见往期：如何做 RNA 干扰实验？(常见问题+解决方案)

图 2. siRNA 作用实验流程示意图。

『siRNA 适用场景』siRNA 最适合用于易于转染、分裂活跃、需要快速验证基因短期功能的实验场景。

一、【适合的细胞系特点】

• 高转染效率细胞：如 HEK293、HeLa、A549、NIH3T3 等常规外源 DNA/RNA 极易进入的细胞。

• 分裂活跃的细胞：细胞分裂能加快转染试剂的摄取，利于 siRNA 快速在细胞质中均匀分布。

• 贴壁细胞：相比于悬浮细胞，贴壁细胞更容易通过常规脂质体转染实现 80% 以上的敲低效率。

二、【适合的实验场景】

• 短期功能研究：实验周期在 24 到 96 小时内 (如短期细胞增殖、凋亡、迁移或瞬时信号通路激活实验)。

• 常规高表达基因：目标 mRNA 表达量正常或偏高，siRNA 可以通过高效降解实现立竿见影的"敲低"效果。

• 高通量靶点筛选：需要同时验证几十甚至上百个候选基因，siRNA 合成快、成本低、转染自动化程度高。

• 致死性基因研究：某些基因完全敲除会导致细胞死亡，而 siRNA 适度降低表达量可以维持细胞存活以供观察。

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『哪些情况不适用 siRNA？』

• 原代细胞与悬浮细胞：如 T 细胞、B 细胞、原代神经元，这类细胞极难转染，通常需要借助慢病毒。

• 长期观察实验：siRNA 沉默效果通常仅维持 3~7 天，实验需要持续数周或数月 (如长期稳转株筛选、动物体内长期观察)，这时更适合用 shRNA 或 CRISPR-Cas9。

• 丰度极高或半衰期极长的蛋白：如果目标蛋白本身非常稳定、不易降解，即使 mRNA 被 siRNA 破坏，原有的蛋白也需要很久才能消耗完，导致短期内看不到敲低效果。

总之，siRNA 是不能盲选的！一旦选错，可能真的撑不起你后续的实验需求。

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质粒、慢病毒、AAV

这 3 种 shRNA 到底"差"在哪？

如果想实现长期基因抑制，就要关注下 shRNA 了！科学家将 RNAi 序列设计为短发卡结构，即 shRNA。将 shRNA 连入病毒或质粒载体导入细胞后，细胞可持续转录 shRNA，实现基因沉默。

shRNA：构建稳转株

与 siRNA 不同，shRNA 可以游离形式存在，载体类型为质粒或腺相关病毒 (AAV) ，腺病毒（图 3A），也可通过慢病毒 (Lentivirus) 转染整合到基因组（图 3B），最终都汇聚于 RISC 复合物。

图 3. shRNA 机制示意图^[4]。

(A) 以质粒为例，质粒 DNA 缺乏“整合酶”和特定的病毒整合序列。质粒进入细胞核后，是作为游离体 (Episome) 游离在染色体之外。它依靠自身的启动子 (如 U6) 转录产生 shRNA。(B) 通过慢病毒 (Lentivirus) 转染整合到基因组：转录后，该产物模拟pri-microRNA，并经 Drosha 加工形成 pre-shRNA，pre-shRNA 随后由 Exportin 5 从细胞核输出。之后，pre-shRNA 经 Dicer 加工并与 RISC 复合物结合。乘客链被降解，反义引导链则引导 RISC 降解互补靶 mRNA。

当然，shRNA 转导载体不同，它们的适用范围也天差地别。

1. 质粒-shRNA (游离体，不整合)

• 递送方式：普通转染试剂 (脂质体/电转)。

• 在细胞内的命运：进入细胞核后，游离在染色体外 (Episome) ，不整合到基因组。

• 核心差异 (差在哪)：

• 优点：构建最快、成本极低 (合成寡核苷酸仅需几百元)；可轻易与其他质粒 (如 GFP 标签) 共转染。

• 致命伤：随细胞分裂而逐渐丢失 (除非用抗生素持续加压，但加压本身会改变细胞状态)；且转染效率受限于细胞类型。

• 真实用途：过渡性工具。常用于低成本海选 shRNA 靶点 (为后续慢病毒做准备)，或进行瞬时共转染的拯救实验。

2. AAV-shRNA (游离体，但极稳定)

• 递送方式：病毒注射 (局部或全身)。

• 在细胞内的命运：进入非分裂细胞 (如神经元、心肌、肝细胞) 后，主要以游离体形式长期稳定存在，极少整合。

• 核心差异 (差在哪)：

• 优点：免疫原性极低、扩散性好、安全性极高 (临床级载体)。在终末分化的不分裂细胞中，游离体不会因分裂丢失，可维持数年。

• 局限：装载容量有限 (<4.7kb)；制备纯化门槛高，生产成本昂贵。

真实用途：动物体内 (In vivo) 的特异性器官敲低。特别是脑立体定位注射 (配合水迷宫行为学) 和心脏/肝脏靶向干预。

3. 慢病毒-shRNA (基因组整合，继承)

• 递送方式：病毒感染 (转导)。

• 在细胞内的命运：病毒携带的 shRNA 表达框通过整合酶插入宿主基因组 DNA。

• 核心差异 (差在哪)：

• 优点：一旦整合，子代细胞表达 shRNA，彻底解决“稀释效应”；能高效攻克质粒转染不进的悬浮细胞、原代细胞。

• 代价：制备周期长 (1~2 周)、生物安全等级要求高 (BSL-2)，且随机插入存在致突变风险。

• 真实用途：长期稳转株的底牌。用于裸鼠皮下成瘤、尾静脉转移模型，以及任何超过 1 周的细胞功能实验。

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siRNA，质粒、AAV、慢病毒，

各类实验到底怎么选？

在分子生物学和细胞生物学研究中，选择以上哪种 RNAi 工具主要取决于：(1) 目标细胞的类型：易转染细胞、难转染细胞或原代细胞？(2) 实验周期：短期瞬时敲低、长期稳定敲低？(3) 是在体外还是体内进行实验？以下整理了详细文献案例，可查找匹配自身实验需求的内容！

一、 选择 siRNA 转染的实验

• 核心特点：化学合成的小片段，通过脂质体等转染试剂直接进入胞质发挥作用。起效极快 (24-48h)，但维持时间短 (一般 3-7 天)。适用于易转染的肿瘤细胞系 (如 HeLa, MDA-MB-231, A549 等) 中开展的短期表型观察。

『RT-qPCR』在转染后 24-48 小时检测目标基因 mRNA 的瞬时敲低效率，或相关基因的表达水平。

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SiRNA Negative Control 是一个 21 个核苷酸的 siRNA，可用作阴性对照。

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Inclisiran sodium 是一种双链小干扰 RNA (siRNA) 分子，可抑制 PCSK9 的转录。

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MicroRNA Mimic Negative Control是 21个核苷酸的 miRNA 模拟物，可作为阴性对照使用。

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Fomivirsen (ISIS-2922) 是一种反义21 mer 磷酸硫寡核苷酸。

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Nusinersen sodium 是一种反义寡核苷酸活性分子，修饰 SMN2 基因的前信使 RNA 剪接。

参考文献：

[1] Bumcrot D, et al. RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs. Nat Chem Biol. 2006 Dec;2(12):711-9.

[2] The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006. NobelPrize.org. Nobel Prize Outreach 2026. Mon. 3 Aug 2026.

[3] Elbashir SM, et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8.

[4] Aguiar S, et al. RNAi mechanisms in Huntington's disease therapy: siRNA versus shRNA. Transl Neurodegener. 2017 Nov 27;6:30.

[5] Amini R, et al. Combination Therapy with PIK3R3-siRNA and EGFR-TKI Erlotinib Synergistically Suppresses Glioblastoma Cell Growth In Vitro. Asian Pac J Cancer Prev. 2021 Dec 1;22(12):3993-4000.

[6] Chen R, et al. Targeting Microglia/Macrophages Notch1 Protects Neurons from Pyroptosis in Ischemic Stroke. Brain Sci. 2023 Nov 29;13(12):1657.

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