D-乳酸是一种重要的手性化学物质，广泛应用于除草剂、涂料、粘合剂、香料和化妆品等领域，它也是生产聚d-乳酸(PDLA)的优良单体。本课题组前期已构建了生产高光学纯d-乳酸的克雷伯氏菌工程菌株。然而，高浓度d-乳酸的积累会阻碍工程菌株的进一步生长和生产，提高工程菌株对d-乳酸的耐受性对于维持细菌正常生长和提高d-乳酸产量都至关重要。适应性进化是目前备受瞩目的菌种改良技术，可以在较短时间内获得适应选择压力的特定表型或生理特性。近日，本课题组应用适应性进化技术，经过22轮的选择压力，分离出八个乳酸耐受性显著提高的肺炎克雷伯突变菌株。随后，基因组重测序在八株进化菌株中共发现4个SNP突变位点，乳酸耐受性分析和qRT-PCR技术揭示了UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶GalU参与细菌的乳酸胁迫响应（图1）。GalU在生物膜和细胞壁生物合成中有重要作用，已被证实在许多细菌的环境胁迫响应中发挥功能。我们的研究首次证实了galU基因与细菌乳酸耐受性之间的相关性。

图1. galU参与肺炎克雷伯菌的乳酸耐受。A：乳酸胁迫后野生型和∆rcsA、∆ydhS和∆galU菌株的存活情况。B：乳酸胁迫后galU缺失、回补或过表达后菌株的存活情况。C: 有无乳酸胁迫下进化菌株A1与野生菌株galU的转录水平。

最后，在3个耐受性最高的进化菌株基础上进一步删除ackA（编码乙酸激酶）、adhE（编码乙醇脱氢酶）和 budB（编码乙酰乳酸合成酶）基因以抑制副产物的积累，获得工程菌株Q5221、Q5224、Q5227，它们的乳酸耐受性和d-乳酸产量均得到显著提高（图2），而相同酸性pH下的盐酸耐受性没有差异。因此，我们提出，进化菌株d-乳酸产量的提高可能是由于获得了对乳酸根离子的耐受性，而不是对低pH的耐受性。在这些工程菌株中，Q5224菌株具有最好的生长能力和最高的d-乳酸产量，摇瓶中d-乳酸产量高达19.56 g/L（图2），是目前已知肺炎克雷伯工程菌株的最高产量。

图2. 工程菌株的乳酸耐受性、细胞生长和d -乳酸生产。A:菌株经乳酸刺激后的存活能力测定。B: 菌株在摇瓶发酵中的生长曲线。C: 菌株在摇瓶发酵中产生的d -乳酸及其副产物。

相关工作发表于Microorganisms期刊，山东大学微生物技术国家重点实验室为第一单位；赵广教授和博士后赵喆为共同通讯作者，博士生蒋波为第一作者。

论文链接：https://www.mdpi.com/2076-2607/12/6/1167

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