撰文 | 屈若颖 殷晓航 李欣茜 郑宇含 张彦康 张婷 李雨

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张婷

背景介绍

免疫检查点（Immune checkpoint）是定位于免疫细胞（尤其是T细胞）表面的一类蛋白质，核心作用是维持免疫系统的平衡。PD-1和PD-L1是一对经典的免疫检查点分子，PD-1主要表达于活化的T细胞表面，PD-L1在多种正常细胞膜（如胎盘滋养层细胞、血管内皮细胞等）上表达。在生理情况下，当免疫系统被激活以应对感染时，PD-1与其配体PD-L1结合后会向T细胞内传递抑制性信号，从而适度抑制T细胞的活化与增殖，防止免疫应答过度而损伤自身正常组织。然而，肿瘤细胞常利用这一免疫调节机制实现免疫逃逸。肿瘤细胞表面高表达的PD-L1与肿瘤浸润T细胞表面的PD-1结合。这种结合会持续、强烈地激活PD-1通路，导致识别该肿瘤抗原的特异性T细胞功能被抑制，从而使肿瘤细胞逃避T细胞的识别与攻击。基于这一机制，免疫检查点抑制剂（ICI）已成为肿瘤治疗的重要手段。以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的ICI疗法，通过特异性阻断PD-1与PD-L1的结合，解除肿瘤对T细胞的免疫抑制，重新激活患者自身的抗肿瘤免疫应答，已在晚期恶性肿瘤患者中展现出显著疗效。

然而，ICI疗法可能诱发多种免疫相关不良事件，包括心血管疾病和血脂异常，尤其在患有肥胖等基础疾病的患者中更为常见。在肥胖状态下，脂肪组织巨噬细胞（ATMs）会促进促炎因子的产生，从而加剧炎症反应，并导致肥胖相关的胰岛素抵抗、血脂异常和代谢综合征。有研究报道，肥胖或脂多糖（LPS，能模拟肥胖诱导的慢性低度炎症）可以选择性增强肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表面PD-1的表达。值得注意的是，巨噬细胞PD-1缺失会促进M1型巨噬细胞极化，并产生促炎因子。这些结果表明，阻断PD-1可能加重慢性低度炎症，从而加剧系统性代谢功能障碍，并且这一不良反应在肥胖状态下可能更加显著。然而，PD-1在调控代谢功能障碍中的作用仍有待阐明。

内质网（ER）应激与肥胖及代谢疾病中的脂肪组织功能障碍密切相关。ER 应激会触发短暂未折叠蛋白反应（UPR），而其持续或过度激活则会导致慢性炎症。在动物模型、肥胖和糖尿病患者中，白色脂肪组织（WAT）中肌醇需求酶1α（IRE1α）通路的过度激活是代谢性ER应激的关键特征。在病理条件下，IRE1α通过诱导IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子来驱动炎症（小编注：内质网应激是指内质网腔内未折叠/错误折叠蛋白过量积聚，导致蛋白折叠稳态失衡的状态。营养过剩、缺氧、氧化应激、钙紊乱等因素均会引起内质网应激，此时细胞会启动短暂的未折叠蛋白反应（UPR）以恢复稳态。若UPR持续或过度激活，会激活IRE1α、PERK、ATF6等传感器，进而通过NF-κB、MAPK等炎症信号通路促使细胞分泌促炎因子，驱动炎症、凋亡或代谢紊乱）。现有研究表明，脂肪细胞中IRE1α敲除可缓解由高脂饮食（HFD）诱导的肥胖，并促进冷暴露或β3肾上腺素能激动剂诱导的皮下WAT棕色化。此外，髓系细胞特异性IRE1α缺失能通过促进M2型巨噬细胞极化，显著改善HFD诱发的肥胖、胰岛素抵抗、高脂血症和肝脏脂肪变性。因此，研究人员推测，巨噬细胞中PD-1与IRE1α之间的交互作用可能在阻断PD-1介导的系统性代谢性免疫相关不良反应中发挥作用。

在本篇文章中，研究人员发现阻断PD-1或髓系细胞特异性PD-1缺失通过促进IRE1α介导的内质网应激，加重HFD诱导的肥胖及代谢紊乱。从机制上讲，LPS通过诱导PD-1 T250磷酸化，抑制PD-1的泛素化降解；同时PD-1 T250磷酸化促进PD-1与IRE1α相互作用，从而抑制IRE1α自磷酸化，减轻内质网应激相关炎症。本研究揭示了巨噬细胞PD-1在调控产热、能量消耗和代谢反应中的关键作用，并提出了一个潜在的干预靶点，为减轻代谢相关的免疫不良反应提供了新思路。

敲黑板啦！

1. ULK1依赖性的PD-1 T250磷酸化阻断其与FBXO38的结合，稳定PD-1蛋白

2. 磷酸化的PD-1与IRE1α结合，抑制ER应激引起的代谢紊乱

3. 靶向IRE1α-XBP1可能缓解ICI引起的代谢功能障碍研究结果

1 PD-1抗体加剧HFD诱导的代谢功能障碍

研究人员首先对9296名癌症患者进行荟萃分析，结果显示，ICI治疗显著增加了全身代谢功能障碍的风险，包括高血糖、高甘油三酯血症及肝酶升高（图S1A）。为了验证ICI治疗介导的代谢紊乱和系统性炎症，研究人员每隔一天给小鼠腹腔注射免疫球蛋白G（IgG）抗体或PD-1抗体，持续12周。结果显示，正常饮食（ND）喂养下，注射IgG抗体小鼠（IgG小鼠）与注射PD-1抗体小鼠（PD-1小鼠）的体重和脂肪组织重量无显著差异（图1A、1B和S1B）。值得注意的是，高脂饮食（HFD）显著增加了IgG小鼠的体重、脂肪组织重量和脂肪细胞平均面积，而该表型在HFD PD-1小鼠中更加显著（图1A、1B、1C和S1B、S1C）。

肥胖及脂肪组织扩张通常与糖耐量受损、胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性有关。接下来研究人员对HFD喂养12周的小鼠进行GTT、ITT，发现PD-1抗体加重了HFD诱导的糖耐量受损、胰岛素敏感性降低（图1D和1E），提高了糖化血红蛋白（HbA1c）和空腹胰岛素水平（图1F和1G）。同时，还进一步促进了HFD引起的肝脏重量增加、肝细胞气球样变和空泡化、脂质堆积（图S1D和S1E），并导致血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平的进一步升高（图S1F）。此外，PD-1抗体还增强了HFD诱导的血清和肝脏甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和非酯化脂肪酸（NEFAs）水平升高（图S1G和S1H）。

食物摄入与能量消耗之间的失衡是导致肥胖的一个关键因素。因此，研究人员探索了二者在PD-1抗体诱导的肥胖和代谢综合征中的作用。代谢笼结果显示，在ND和HFD条件下，PD-1抗体均不影响小鼠的食物摄入（图S1I），但显著降低了能量消耗，光照期和黑暗期的氧气消耗（VO2）与二氧化碳产生（VCO2）均明显减少（图1H-1K）。通过检测基因表达，发现在ND和HFD条件下，PD-1抗体显著降低小鼠iBAT中关键产热基因的mRNA水平，包括解偶联蛋白1（Ucp1）、细胞死亡诱导DFT45样效应因子（Cidea）、PR结构域蛋白16（Prdm16）、细胞色素c氧化酶亚基8B（Cox8b）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（Ppargc1a）。同时iBAT中UCP-1、PGC-1α和PPAR-γ的蛋白水平均显著下降（图1L-1O和S1J）。值得注意的是，在HFD喂养的野生型（WT）肥胖小鼠模型中，PD-1抗体同样导致全身代谢紊乱进一步恶化，并抑制上述能量消耗相关基因与蛋白的表达（图S1K-S1T），而不影响食物摄入。这些发现表明，PD-1阻断通过降低能量消耗，加剧HFD诱导的肥胖和肥胖相关代谢紊乱。

图1.PD-1抗体加剧HFD诱导的肥胖和代谢功能障碍

图S1.PD-1抗体加剧HFD诱导的肥胖及肥胖相关代谢紊乱

2 髓系细胞特异性敲除PD-1加剧HFD诱导的肥胖及其相关代谢功能障碍

PD-1在多种免疫细胞中广泛表达。其中，髓系细胞是固有免疫的核心，中性粒细胞是急性炎症的第一反应者，T细胞是免疫系统的核心调控者，同时也是PD-1的经典作用细胞，这几种免疫细胞类型在肥胖和代谢炎症中发挥主要作用。因此，研究人员构建了髓系细胞、中性粒细胞和T细胞特异性PD-1敲除小鼠（分别对应Lyz2-Cre、Ly6G-Cre和CD4-Cre），以确定哪种类型的免疫细胞参与了PD-1抗体对HFD诱导的肥胖的促进作用（图S2A）。结果显示，中性粒细胞和T细胞特异性PD-1敲除不影响HFD导致的肥胖、糖耐量受损、胰岛素抵抗、关键能量消耗相关基因和蛋白的表达（图S2B-S2K），进食量也不受影响。然而，髓系细胞特异性PD-1敲除能显著加剧HFD诱导的肥胖，使iBAT、iWAT和eWAT的重量显著增加（图2A、2B和S2L），同时促进iBAT中单房脂滴大小以及iWAT和eWAT中脂肪细胞体积的增加（图2C和S2M）。此外，髓系细胞特异性PD-1敲除会进一步加重代谢紊乱指标，包括糖耐量受损和胰岛素抵抗（图2D和2E）、HbA1c水平和空腹胰岛素升高（图2F和2G）、肝脏重量增加、肝细胞气球样变加剧和肝脏脂质堆积（图S2N和S2O），以及血清ALT和AST水平显著性升高（图S2P）。同时，还促进血清和肝脏TG、TC和NEFA水平的显著升高（图S2Q和S2R）。

在ND和HFD条件下，髓系细胞特异性PD-1敲除均不影响小鼠的摄食量（图S2S），但显著降低了能量消耗，光照期和黑暗期的氧气消耗（VO2）与二氧化碳产生（VCO2）均明显减少（图2H-2K），同时下调能量消耗相关基因和蛋白的表达水平（图2L-2O和S2T）。这些发现表明，髓系细胞表达的PD-1是介导PD-1抗体加剧HFD诱导肥胖的关键分子。

图2.髓系细胞特异性PD-1敲除加重HFD诱导的肥胖和代谢功能障碍

图S2.髓系细胞特异性PD-1敲除会加剧HFD诱导的肥胖和肥胖相关代谢紊乱，而非中性粒细胞或T细胞特异性PD-1敲除

3 抑制髓系细胞中的PD-1会损害适应性产热和WAT棕色化的能力

能量消耗减少通常与产热功能受损有关，而产热受损又会进一步影响WAT棕色化。研究人员进行急性冷暴露（ACC，4°C持续6小时）实验，检测髓系细胞特异性PD-1敲除是否影响小鼠的适应性产热能力。结果显示，ACC后，髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠的能量消耗显著降低（图3A和3B），同时抵御ACC的能力下降（图3C）。值得注意的是，在慢性冷暴露（CCC，4°C持续7天）条件下，髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠iBAT和iWAT的脂肪细胞大小显著变大（图3D和3E），UCP-1免疫荧光强度和蛋白水平降低（图3F-3I），同时iBAT和iWAT中关键产热基因（Ucp1、Cidea、Prdm16、Cox8b和Ppargc1a）mRNA水平显著降低（图3J和3K），表明髓系细胞特异性PD-1敲除损害了iBAT的产热能力以及iWAT响应CCC的棕色化能力。研究人员连续4天给小鼠腹腔注射β3-肾上腺素受体激动剂CL-316,243（0.5 mg/kg）以诱导iWAT棕色化，结果显示髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠iWAT中UCP-1蛋白表达显著降低（图3L和3M）。这些数据表明，髓系细胞表达的PD-1调控iWAT棕色化，其缺失会损害适应性产热能力。

有研究指出脂肪组织巨噬细胞（ATMs）浸润介导的炎症会促进肥胖相关的代谢紊乱。研究人员推测，髓系细胞特异性PD-1敲除可能通过促进促炎单核细胞的扩增来增强全身炎症反应。流式细胞术结果表明，在髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠外周血中，Ly6Chigh单核细胞的数量在RT或CCC条件下均特异性增加，Ly6G+中性粒细胞数量在CCC条件下显著减少，而髓系细胞总数在两种条件下均没有变化（图3N-3P和S3A）。这些发现表明，PD-1缺失介导的外周血Ly6Chigh促炎单核细胞的扩增是导致WAT产热和棕色化功能受损的原因。

图3.巨噬细胞PD-1缺失损害冷暴露诱导的产热增强和WAT棕色化

图S3.巨噬细胞PD-1缺失通过促进M1型巨噬细胞极化，加剧HFD诱导的促炎性细胞因子的表达

4 髓系细胞特异性PD-1敲除会导致慢性炎症并促进ATM积累

研究人员接下来探索了髓系细胞特异性PD-1敲除是否通过影响巨噬细胞极化介导的全身炎症来增强HFD诱导的肥胖。结果表明，HFD小鼠的血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平升高（图4A-4C），以及iWAT中Il1b、Tnf、Il6和Ccl2的mRNA水平升高（图4D-4G），在髓系细胞特异性PD-1敲除后均进一步加剧。对eWAT进行RNA测序（RNA-seq），DEG分析结果表明，髓系细胞特异性PD-1敲除后有254个基因上调，286个基因下调（图4H）。GO分析显示，这些差异基因主要富集于细胞因子产生的正向调控信号通路（图4I）。

此外，在ND和HFD条件下，髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠的骨髓源性巨噬细胞（BMDM）中Il1b、Il6、Tnf和Ccl2的mRNA水平均显著上升，而HFD条件下上升更显著（图S3B）。同样，在ND条件下，研究人员用LPS诱导小鼠产生肥胖所致的慢性低度炎症后，发现髓系细胞特异性PD-1敲除同样能显著增加上述炎性细胞因子的mRNA表达水平（图S3C）。随后，研究人员用LPS处理RAW264.7细胞（一种小鼠巨噬细胞系），发现PD-1抗体进一步增强了LPS对Il1b、Il6、Tnf和Ccl2mRNA水平的上调（图S3D）。在RAW264.7细胞和WT小鼠原代BMDM细胞中，研究人员检测发现PD-1抗体进一步增强了LPS对巨噬细胞中一氧化氮合酶（iNOS，M1巨噬细胞标记物）蛋白表达的上调作用。iNOS蛋白表达水平增加。而在髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠原代BMDM细胞中也得到相同的结果（图S3E和S3F）。研究人员通过免疫荧光共定位发现，髓系细胞特异性PD-1敲除显著增加了小鼠eWAT中F4/80+ ATMs的数量，其中绝大多数是iNOS+ F4/80+ ATMs，标志促炎M1型巨噬细胞。同时CD206+ F4/80+ M2型巨噬细胞数量没有改变（图S3G-S3J）。这些数据表明，巨噬细胞PD-1通过抑制巨噬细胞向M1型表型转换，从而负调控脂肪组织炎症。

图4.巨噬细胞PD-1缺失促进HFD诱导的全身炎症反应

5 肥胖或LPS促进巨噬细胞PD-1的表达

研究人员发现，肥胖患者外周血中表达PD-1的单核细胞数量显著增加，但在T细胞、中性粒细胞或NK细胞中没有变化（图4J、4K和S3K-S3N）。在BMDM、THP-1细胞（可分化成巨噬细胞）和RAW264.7细胞中，LPS以时间依赖方式显著上调PD-1蛋白水平（图4L-4Q）。此外，在WT小鼠原代BMDM中，HFD显著增加了PD-1蛋白表达（图4R和4S）。而上述四种细胞模型中PD-1 mRNA水平均不受影响（图4T-4W）。这些数据表明，PD-1的上调发生在翻译后水平而非转录水平，作为一种内在保护机制来对抗肥胖相关的应激或炎症刺激。（小编注：在体内和体外，均有文章用LPS来模拟肥胖中的慢性炎症。有研究表明，HFD会破坏小鼠肠道屏障功能，导致肠道细菌产生LPS进入循环系统，促进小鼠血浆LPS水平升高。而持续注射低剂量LPS可引发全身性低度炎症，模拟HFD诱导的肥胖和胰岛素抵抗（Diabetes, 2007）。另有研究表明，分别用FFA和LPS处理巨噬细胞、脂肪细胞，FFA的处理结果与LPS相似，均能通过激活TLR4进而激活NF-κB和JNK炎症通路，诱导炎症因子的释放，此外还会干扰胰岛素信号传导（J Clin Invest, 2006）。因此，在体内和体外均可用LPS模拟肥胖中的慢性炎症）

6 PD-1在LPS刺激下与IRE1α结合

为了探究PD-1在肥胖相关炎症中的作用，研究人员在LPS刺激的RAW264.7细胞中免疫沉淀PD-1的互作蛋白，发现一条110kDa的蛋白仅在LPS处理后与PD-1结合。质谱分析鉴定该蛋白为IRE1α蛋白（图5A），它是‌内质网（ER）跨膜蛋白，在ER应激中发挥关键调节作用。在THP-1和RAW264.7细胞中进行Co-IP，发现LPS处理显著促进PD-1和IRE1α相互作用（图5B）。为了鉴定IRE1α中参与结合的关键结构域，研究人员构建了一系列Myc-IRE1α截短和缺失突变体（图S4A）。值得注意的是，IRE1α腔内结构域（1-445aa）、跨膜结构域（446-466aa）和激酶结构域（467-832aa）能够与PD-1结合，而RNase结构域（833-977aa）则不能（图S4A）。而在PD-1中，其胞质区（194-288aa）对LPS刺激下与IRE1α的结合至关重要（图S4B）。疏水作用力是蛋白质折叠和蛋白质-蛋白质结合的主要驱动力，研究人员对PD-1蛋白胞质区（194-288aa）中的所有疏水氨基酸残基进行突变，结果显示V223E、I251T和A268N的单独突变均抑制了LPS诱导下PD-1/IRE1α复合物的形成（图S4C）。为了确定这三个疏水残基是否是ER内PD-1/IRE1α相互作用所必需的，研究人员提取全细胞裂解物（WCL）与内质网提取物（ER），检测蛋白水平发现LPS刺激导致10%–15%的PD-1重新分布到ER区室中（图S4D）。另外，LPS分别显著增强了PD-1与Calnexin（钙联蛋白，ER标记物）以及与IRE1α的共定位（图S4E和S4F）。而在重建表达PD-1三突变体（PD-1 3mut，突变V223E/I251T/A268N位点）的细胞中，上述LPS诱导的PD-1和IRE1α在ER中的共定位现象被消除（图S4E和S4F）。这些数据表明，PD-1的三个疏水氨基酸对于ER中PD-1/IRE1α复合物的形成至关重要。

图S4.LPS诱导的ULK-1依赖性PD-1 T250磷酸化促进ER内PD-1/IRE1α复合物的形成

7 mTOR介导的ULK1依赖性PD-1 T250磷酸化增强LPS诱导的PD-1和IRE1α之间的相互作用

为了探究LPS刺激期间PD-1/IRE1α复合物形成的信号通路，研究人员先在LPS激活的四条经典通路中进行筛选，用抑制剂BX795、IKK-16、IRAK-1/4iI和SBI-0206965处理RAW264.7细胞，以抑制LPS诱导的TBK1、IκBα/β、IRAK4或ULK1的蛋白活性（分别对应TRIF-干扰素轴、NF-κB轴、MyD88–IRAK4轴和自噬/代谢轴）。其中值得注意的是，只有ULK1抑制剂SBI-0206965能阻断LPS诱导的PD-1/IRE1α复合物形成（图5C和S4G），还破坏了PD-1与IRE1α的共定位和相互作用（见图S4H和S4I）。这些结果表明，LPS诱导的PD-1/IRE1α复合物形成依赖于ULK1。

ULK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在自噬的启动中发挥关键调控作用，并且能被LPS激活。Co-IP实验证实LPS促进THP-1和RAW264.7细胞中ULK1与PD-1的结合（图S4J）。谷胱甘肽S-转移酶下拉实验（GST pull-down）结果显示，在体外GST-PD-1能与His-ULK1发生相互作用（图S4K）。体外激酶活性实验表明，在ATP-γ-S存在的情况下，只有活性ULK1 WT能够磷酸化纯化的PD-1，ULK1 KD（激酶失活突变体）则不能（图S4L）。随后，研究人员进行质谱分析，鉴定出磷酸化位点为保守的PD-1 T250（小编注：文中进行了四极杆-静电场轨道阱组合质谱（Q Exactive HF-X）分析，较LC-MS/MS而言分辨率更高，能区分质量差异极小的分子，如化学修饰与干扰峰。研究人员先从免疫沉淀产物中分离PD-1，然后酶切生成肽段混合物。酶切肽段经纳流液相色谱分离后，进入Q Exactive HF-X组合质谱系统进行高质量精度扫描，再通过分析软件检测目标离子峰。接下来与蛋白质序列数据库进行比对，发现该离子的精确质量与源自PD-1蛋白序列（第234-264位氨基酸）的胰酶肽段在T250位点磷酸化后的理论质量高度吻合，提示存在目标修饰。最后再将该候选离子碰撞破碎，对其碎片离子进行二级质谱验证，最终确认肽段的氨基酸序列和T250位点的磷酸化修饰）（图S4M和S4N）。将T250突变为丙氨酸（T250A）后，消除了ULK1介导的磷酸化（图5D）。此外，在RAW264.7细胞中敲减ULK1或重建表达ULK1 KD突变体，均可以消除LPS介导的PD-1 T250位点的磷酸化（图S4O和S4P）。同时，重建表达PD-1 T250A（磷酸化缺陷突变体），能消除LPS诱导的PD-1 T250磷酸化（图5E、图S4Q和S4R）。这些发现表明，ULK1在LPS处理下能够磷酸化PD-1 T250位点。

为了评估ULK1诱导的PD-1 T250磷酸化对PD-1/IRE1α相互作用的影响，研究人员进行了GST pull-down实验，发现在ULK1存在的条件下，纯化的WT PD-1（非PD-1 T250A）能够与IER1α结合，而SBI-0206965会抑制其结合（图5F）。此外，在THP-1和RAW264.7细胞中重建表达PD-1 T250A，同样抑制了LPS诱导下PD-1与IRE1α的结合，而磷酸突变体PD-1 T250D则在未用LPS处理的情况下与IRE1α相互作用（图5G、图S4Q和S4R）。分子动力学（MD）模拟显示，磷酸化的PD-1与IRE1α建立了稳定的相互作用界面（小编注：文中首先通过Alphafold3.0生成PD-1和IRE1α初始结构模型，再使用Schrödinger Suite软件进行分子对接和分子动力学模拟。具体而言，研究人员先进行分子对接来模拟二者的分子相互作用界面及结构，软件能对PD-1/ULK1复合物进行自动化预处理，通过调整原子位置使结构更稳定。接着将PD-1/ULK1复合物放入模拟的生理环境中进行分子动力学模拟，软件会根据牛顿运动方程计算每个原子的受力和运动，预测原子在受力下的运动轨迹。模拟后，研究人员分析了生成的轨迹以评估结构稳定性，主要是通过计算复合物在模拟过程中相对于初始结构的均方根偏差（RMSD值）来进行定量。RMSD值如果在模拟后期趋于平稳并在一个较小的范围内波动（例如2-3 Å），则表明复合物构象稳定，相互作用界面稳定。文中没有给出具体的RMSD值，在图S4W和S4X中展示了分子动力学模拟路线图，其中曲线距离波动越大表示相互作用稳定性越低。同理，构建突变体后按上述步骤进行分子动力学模拟，判断相互作用界面是否稳定）（图S4S和S4T）。多种IRE1α残基均位于交互界面中，包括Glu250、Thr251、Tyr254、Ile245、Tyr270、Pro271、Phe272、Val306、Ile336、Thr337、Pro338、Thr340、Tyr168、Arg173、Glu174、Leu175、Ile406、Arg430、Leu456、Trp459、Val460、Ser724、Ser726、Arg727和Arg728（图S4U）。该界面的稳定主要由PD-1关键残基维持（小编注：在通过Schrödinger Suite软件进行分子动力学模拟的过程中，能分析出具体残基的相关参数参数，例如各残基对结合自由能的贡献、残基对间形成的氢键数量以及残基对间是否存在稳定的疏水核心区域等，从而综合评价各氨基酸残基在蛋白相互作用中的贡献。研究人员通过分析这些参数得出“PD-1关键残基维持PD-1/IRE1α相互作用界面的稳定”这一结论，但文中仅展示了包含PD-1关键残基的构象图，体现相互作用界面的紧密与松散程度，未给出具体参数），它们与IRE1α形成氢键和疏水相互作用，包括TPO 250（磷酸化后的T250）、Val223、Ile251和Ala268（图S4T-S4V）。然而，未磷酸化的PD-1和PD-1 3mut不能与上述IRE1α区域建立稳定接触，并且无法模拟出一致的相互作用界面（图S4W和S4X），表明PD-1 T250磷酸化诱导发生构象变化，使其通过Val223、Ile251和Ala268与IRE1α保持稳定结合。

随后，研究人员通过PD-1和IRE1α免疫荧光共定位技术，研究PD-1与IRE1α在内质网内相互作用是否需要PD-1 T250磷酸化。值得注意的是，LPS显著增强了PD-1与Calnexin和IRE1α的共定位（图S5A和S5B），但重建表达PD-1 T250A（图S5A–S5C）和PD-1 3mut（图S4E和S4F）后共定位消失。值得注意的是，在没有LPS刺激的条件下，PD-1 T250D仍能与Calnexin和IRE1α共定位（图S5D和S5E）。进一步验证发现，加入外源性PD-1 T250肽段能够抑制LPS诱导的内源性PD-1磷酸化及其与IRE1α的相互作用（图S5F和S5G），并消除PD-1与IRE1α的共定位（图S5H），而PD-1 T250A肽段则无此效应（小编注：作者在上文中证明，PD-1 T250磷酸化后会发生构象变化，使其通过Val223、Ile251和Ala268与IRE1α结合。这里加入的外源性PD-1 T250肽段和PD-1 T250A肽段均只是PD-1 250位点附近的一段氨基酸序列，不具备和IRE1α结合的三个位点，因此我们推测只有内源性PD1能与IRE1a结合）。为了阐明PD-1/IRE1α复合物的形成是否触发PD-1内质网易位，研究人员在RAW264.7细胞中分别重建表达rPD-1 T250D和rPD-1 T250D/3mut（T250磷酸化突变，以及Val223、Ile251和Ala268三个疏水残基突变）。值得注意的是，PD-1 T250D（而非PD-1 T250D/3mut）能够与IRE1α相互作用并与Calnexin共定位（图S5I–S5K）。

有研究表明，LPS能够通过TLR（Toll样受体）激活mTOR，激活的mTOR能够直接磷酸化ULK1（S757）。因此，研究人员用LPS处理RAW264.7细胞不同时间，发现LPS在1小时内显著激活mTOR-ULK1-PD-1轴，表现为mTOR S2448、ULK1 S757和PD-1 T250磷酸化水平升高。然而，LPS刺激1小时未引起AMPKα T172磷酸化（图S5L）。进一步研究发现，mTOR敲减和重建表达激酶失活突变体mTOR D2338A均显著抑制LPS诱导的ULK1 S757和PD-1 T250磷酸化，并阻断PD-1和IRE1α的相互作用（图S5M和S5N）。这些结果说明，mTOR位于ULK1的上游，是LPS诱导PD-1磷酸化及后续PD-1/IRE1α复合物形成的关键上游激酶（小编注：HFD能通过多种途径激活mTOR，LPS诱导的炎症信号只是其中一个途径（Sci Transl Med, 2025; Cell, 2012）。在现有研究中，HFD主要通过以下途径调控mTOR，一是直接营养信号途径，HFD后细胞产生的特定脂质代谢产物可以直接调控mTOR，例如HFD引发的过量磷脂酸可以直接激活mTORC1；二是激素与能量信号途径，例如HFD促进胰岛素水平代偿性升高，导致胰岛素通过PI3K/Akt/mTOR通路激活mTORC1；三是炎症信号途径，例如LPS激活TLR4后，可通过MyD88依赖途径激活 IKKβ/NF-κB，进而调控mTORC1）。

  图S5.mTOR/ULK1依赖性PD-1 T250磷酸化会促进PD-1/IRE1α复合物的形成，从而抑制由IRE1α激活所介导的促炎信号传导

8 ULK1介导的PD-1 T250磷酸化抑制LPS诱导的IRE1α激活

IRE1α能介导Xbp1 mRNA剪接产生转录因子Xbp1s，进而驱动促炎细胞因子的表达，这是IRE1α介导炎症发生的经典通路。研究人员接下来检测了PD-1/IRE1α相互作用是否影响THP-1和RAW264.7细胞中LPS介导的促炎细胞因子增加。结果显示，LPS增强了IRE1α S724磷酸化水平、Xbp1 mRNA的剪接以及促炎细胞因子（Il1b、Il6、Tnf和Ccl2）的转录水平（图5H-5P、S5O和S5P）。重建表达PD-1 T250A或ULK1敲减进一步增强了LPS介导的IRE1α激活和促炎细胞因子表达（图5H-5P、S5O和S5P）。

有研究表明，棕榈酸（PA）通过激活TLR4诱导ER应激，是驱动巨噬细胞代谢激活的主要信号，诱导细胞产生肥胖型巨噬细胞表型（小编注：有研究表明，棕榈酸能通过直接结合MD2蛋白（TLR4辅助蛋白）来激活TLR4，进而诱导ER应激。用葡萄糖、胰岛素和棕榈酸模拟代谢功能障碍环境，可以诱导巨噬细胞表现出“代谢性激活”表型，能激活PPARγ和p62（一种选择性自噬受体）通路，具有促进脂质代谢并限制过度炎症的双重作用（Nat Commun, 2017; Cell Metab, 2014）。）。值得注意的是，在重建表达PD-1 T250A或PD-1 3mut的RAW264.7细胞中，PA处理引发了更强烈的IRE1α激活，表现为IRE1α S724磷酸化增强、Xbp1剪接增加、促炎细胞因子Il1b、Il6、Tnf和Ccl2转录水平升高、以及RIDD（受IRE1α调控的mRNA降解）靶点Col6a1、Pdgfrb和Bloc1的mRNA水平受到抑制（图S5Q-S5S）。在THP-1和RAW264.7细胞中，重建表达PD-1 T250A对IRE1α S724磷酸化的促进比PD-1 T250D更强（图S5T）。此外，在THP-1和RAW264.7细胞中，ULK1 KD（激酶失活突变体）比ULK1 CA（组成型活性突变体）表现出更高的PA诱导的IRE1α S724磷酸化（图S5U）。这些结果表明，PD-1 T250磷酸化及其与IRE1α的结合对抑制PA驱动的IRE1α过度激活至关重要。流式细胞术结果表明，HFD显著增加了ATMs中ULK1 S757、PD-1 T250和IRE1α S724的磷酸化水平（小编注：流式细胞术能在单细胞水平上进行检测，同时结合细胞表面marker，将磷酸化信号精确定位到特定的细胞亚群上（如本文中检测脂肪组织ATMs中ULK1 S757、PD-1 T250和IRE1α S724的磷酸化水平）；可以同时检测数万个细胞的多个参数（如多个磷酸化位点+多个marker）；还能通过平均荧光强度（MFI） 进行定量，较WB而言能更灵敏地反映磷酸化水平的变化）。另外，髓系细胞特异性PD-1敲除消除了ATMs中PD-1 T250的磷酸化，而IRE1α S724的磷酸化则显著增强，而ULK1 S757的磷酸化水平则没有变化（图S5V-S5Y）。这些结果表明，ULK1介导的PD-1 T250磷酸化及其与IRE1α的结合对于抑制IRE1α激活至关重要。

现有研究表明，当ER腔内未折叠蛋白过量时，IRE1α会发生自体二聚化和寡聚化，从而导致激酶的自磷酸化。研究人员在THP-1和RAW264.7细胞中共转染Myc-PD-1和分别带FLAG、HA标记的IRE1α，发现PD-1可以抑制带有不同标记的IRE1α的二聚化（图5Q）。此外，在PD-1敲减的RAW264.7细胞中重建表达PD-1 T250A，显著增强了LPS诱导的IRE1α二聚化/寡聚化，表明PD-1 T250磷酸化抑制IRE1α激活（图5R）。为了确认PD-1的胞质区段是否阻断IRE1α二聚化/寡聚化，研究人员在RAW264.7细胞中重建表达PD-1 WT、PD-1 T250A和PD-1 ΔCyto（胞质区段缺失的PD-1），结果显示PD-1 T250A和PD-1 ΔCyto的重建表达均能显著促进LPS诱导的IRE1α激活，表现为IRE1α磷酸化及二聚体/寡聚体化增强（图S6A），该结果支持了前文PD-1胞质区段在LPS处理下对IRE1α的抑制作用。

BIP是破坏IRE1α二聚化并抑制其RNase活性的关键调节因子，为了进一步确定磷酸化的PD-1是否通过影响IRE1α与BIP的解离来抑制LPS诱导的IRE1α激活，研究人员在RAW264.7细胞中敲减PD-1后重建表达PD-1 WT、PD-1 T250A或PD-1 3mut。结果显示，PD-1 T250A和PD-1 3mut显著阻断了IRE1α/PD-1复合物的形成，并增强了LPS处理后IRE1α和BIP的解离（图S6B）。PD-1 T250A和PD-1 3mut进一步促进LPS诱导的IRE1α激活，表现为IRE1α磷酸化增强（图S6C）、Xbp1剪接增加、促炎细胞因子Il1b、Il6、Tnf和Ccl2转录上调，以及RIDD靶点（Col6a1、Pdgfrb和Bloc1）的转录下调（图S6D和S6E）（小编注：IRE1α是一种跨膜蛋白，具有 Ser/Thr 蛋白激酶和核糖核酸内切酶（RNase）活性。IRE1α能感应未折叠蛋白而被激活，从而激活未折叠蛋白反应（UPR），维持内质网功能和细胞代谢稳态（Trends Immunol, 2015）。具体而言，内质网中未折叠蛋白的累积促进IRE1α在内质网膜上发生二聚化，并通过自身磷酸化激活RNase活性。一方面，RNase活性可以催化XBP-1（X-box 结合蛋白-1） mRNA的剪接，生成具有活性的转录因子XBP-1s。XBP-1s与内质网应激响应元件结合，增强内质网伴侣蛋白基因（如 BiP）的转录以增强折叠能力；同时 XBP-1s能激活下游炎症信号通路从而上调促炎因子（I11b、I16、Tnf和Cc12等）的表达。另一方面，IRE1α RNase活性还可以选择性降解mRNA，这一过程称为RIDD（IRE1α依赖性调节降解）。例如，通过降解细胞外基质关键成分 Col6a1 mRNA 影响组织纤维化进程；通过降解血小板衍生生长因子受体B（Pdgfrb） mRNA 干扰细胞增殖与组织修复信号；以及通过降解涉及囊泡运输的 Bloc1 复合体相关组分mRNA影响细胞内吞与分泌功能）。BIP敲减可以在很大程度上逆转上述由PD-1 T250A和PD-1 3mut介导的IRE1α激活促进作用（图S6C-S6E），表明PD-1以BIP依赖性方式抑制LPS诱导的IRE1α激活。

由于PD-1的表达和ULK1的激活均可被IL-6促进，因此研究人员用LPS处理RAW264.7细胞，以研究自分泌的IL-6是否能上调PD-1表达和激活ULK1，进而通过负反馈环路抑制IRE1α信号传导。与先前研究结果一致，LPS刺激12小时后上清中的IL-6水平没有变化（图S6F）。ULK1 S757和PD-1 T250的磷酸化水平在LPS刺激后迅速增加，且表现出时间依赖性（图5H-5K和S5O）。重要的是，重建表达PD-1 T250A和ULK1敲减抑制PD-1 T250磷酸化，并显著增强了IRE1α S724磷酸化（图5H-5K和S5O），表明LPS诱导的PD-1 T250磷酸化是抑制IRE1α过度激活的早期事件，而非依赖IL-6的负反馈。

接下来，研究人员进一步验证了髓系细胞特异性PD-1敲除是否通过激活巨噬细胞IRE1α来加剧HFD诱导的肥胖和炎症。值得注意的是，在HFD PD-1小鼠BMDM（图S6G）和LPS诱导下敲减PD-1的WT小鼠原代BMDM中（图S6H），IRE1α S724磷酸化水平均进一步增强。LPS或PA处理促进了BMDM中IRE1α的激活（图S6I和S6J），增强Xbp1剪接，上调促炎细胞因子Il1b、Il6、Tnf和Ccl2转录水平，以及下调RIDD靶点（Col6a1、Pdgfrb和Bloc1）转录水平（图S6K和S6L），而这些效应在髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠的BMDM中进一步增强。

为了阐明PD-1 T250磷酸化在HFD诱导代谢紊乱中的保护作用，研究人员给髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠注射AAV9-F4/80-vector（作为对照）、AAV9-F4/80-PD-1 WT或AAV9-F4/80-PD-1 T250A，经检测均在小鼠原代腹膜巨噬细胞中成功表达（图S7Q）。重要的是，髓系细胞特异性PD-1敲除进一步加剧HFD 诱导的肥胖和肥胖相关代谢紊乱（图S7A-S7G），表现为能量消耗降低、关键产热基因和蛋白表达下调（图S7A-S7O），以及IRE1α激活的促进和促炎基因表达上升（图S7P和S7Q），同时不影响食物摄入。AAV9-F4/80-PD-1 WT的注射挽救了髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠中上述HFD诱导的表型，而非AAV9-F4/80-PD-1 T250A（图S7A-S7Q）。这些结果共同表明，ULK1介导的PD-1 T250磷酸化能抑制IRE1α激活，从而改善 HFD诱导的肥胖和代谢紊乱。

图S6.PD-1 T250磷酸化以BiP依赖的方式抑制LPS诱导的IRE1α激活及促炎信号传导，髓系细胞特异性PD-1敲除促进骨髓源性巨噬细胞中IRE1α激活介导的促炎细胞因子产生

图S7.PD-1 T250磷酸化对改善HFD引起的肥胖和代谢紊乱是必需的

9 PD-1 T250磷酸化通过破坏其与FBXO38的相互作用以及FBXO38介导的PD-1泛素化来稳定PD-1蛋白

为了验证LPS刺激可能稳定PD-1蛋白的假设，研究人员用LPS处理RAW264.7和THP-1细胞。值得注意的是，在环己酰亚胺（CHX，mRNA翻译抑制剂）处理后，LPS或重建表达PD-1 T250D均显著延长了RAW264.7和THP-1细胞中PD-1的半衰期（图6A-6D、S8A和S8B），表明PD-1表达受翻译后调控。而重建表达PD-1 T250A 后则逆转了LPS诱导的PD-1蛋白的上调（图6E）。此外，重建表达ULK1 KD可阻断LPS诱导的PD-1 T250磷酸化，并抑制PD-1蛋白水平的增加（图6F）。这些发现表明，LPS诱导的ULK1依赖性PD-1 T250磷酸化可增强PD-1蛋白的稳定性。

PD-1能够被泛素-蛋白酶体系统降解，该过程受FBXO38和MDM2等E3泛素连接酶以及去泛素化酶USP5的调节。为研究PD-1 T250磷酸化是否调节PD-1与泛素调节因子的相互作用，研究人员通过Co-IP发现，LPS选择性地破坏了WT PD-1与FBXO38之间的相互作用，而不影响PD-1与MDM2或USP5的结合（图6G）。另外，LPS并未破坏PD-1 T250A与FBXO38之间的结合（图6G），表明LPS介导的PD-1 T250磷酸化对于PD-1与FBXO38的解离是必要的。FBXO38是PD-1的E3连接酶，介导K48连接的多聚泛素化及随后的蛋白酶体降解。研究人员证明，在重建表达WT PD-1的THP-1和RAW264.7细胞中， LPS诱导的PD-1 T250磷酸化抑制了FBXO38介导的PD-1 K48连接的多聚泛素化，但在重建表达PD-1 T250A 的细胞中则无此效应（图6H）。与WT PD-1相比，PD-1 T250D的蛋白稳定性显著增强，这归因于其与FBXO38的结合被消除，避免了K48连接的多聚泛素化（图S8C）。在体外泛素化实验中，FBXO38介导了WT PD-1的泛素化，但不介导PD-1 T250D的泛素化（图6I）。LPS处理或重建表达ULK1 CA（组成型活性突变体）均显著降低了PD-1 K48连接的多聚泛素化及其与FBXO38的相互作用（图S8D）。重要的是，重建表达PD-1 T250A或ULK1 KD（激酶失活突变体）逆转了LPS诱导的PD-1半衰期延长和K48连接的多聚泛素化减少（图S8E-S8H）。值得注意的是，FBXO38敲减完全逆转了上述重建表达PD-1 T250A或ULK1 KD后的表型（图6J-6N）。这些结果表明，LPS通过破坏PD-1与FBXO38的相互作用，并抑制随后的泛素化来稳定PD-1蛋白。

此外，重建表达PD-1 3mut消除了LPS介导的PD-1与IRE1α的相互作用，而不影响PD-1 T250磷酸化及其与FBXO38的相互作用（图S8I）。与PD-1 T250A相比，重建表达PD-1 T250D不仅增强了其与IRE1α的相互作用，还破坏了其与FBXO38的结合以及随后的PD-1泛素化（图S8J）。PD-1 T250D/3mut特异性破坏了其与IRE1α的相互作用（图S8J）。然而，与PD-1 T250A相比，重建表达PD-1 T250D和T250D/3mut均降低与FBXO38的结合亲和力以及随后的PD-1泛素化（图S8J）。此外，在THP-1和RAW264.7细胞中重建表达PD-1 WT和PD-1 K233R（泛素化缺陷突变体），LPS刺激都诱导了PD-1 T250磷酸化及其与IRE1α的相互作用（图S8K）。这些数据表明，PD-1 T250磷酸化导致两个独立事件的发生：一是促进PD-1/IRE1α复合物形成，二是破坏PD-1与FBXO38的结合。

图6.PD-1 T250磷酸化通过破坏PD-1蛋白与FBXO38的相互作用和FBXO38介导的泛素化来稳定PD-1蛋白

图S8.FBXO38与PD-1相互作用并介导其发生泛素化

10 IRE1α RNase抑制剂或IRE1α敲除可挽救髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠中HFD诱导的代谢紊乱

为了验证PD-1阻断介导的IRE1α激活是加剧HFD诱导代谢紊乱的关键因素，研究人员给小鼠腹腔注射溶剂或10 mg/kg 4μ8C（抑制IRE1α的RNA酶活性）。结果显示4μ8C能挽救髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠中HFD诱导的一系列表型，包括肥胖，BMDM和iWAT中Xbp1 mRNA剪接增加，促炎细胞因子Il1b、Il6、Tnf和Ccl2转录上调以及对RIDD靶点（Col6a1、Pdgfrb和Bloc1）的抑制（图S9A-S9E）。同时，4μ8C还显著改善了肥胖相关代谢紊乱，包括脂肪细胞大小、葡萄糖耐量、胰岛素敏感性、HbA1c、空腹血胰岛素水平、肝脏重量、肝脂肪变性、脂质沉积、血清和肝脏TC、TG和NEFA水平（图S9F-S9N）。此外，代谢笼分析结果显示，4μ8C恢复了HFD PD-1小鼠的能量消耗而不影响食物摄入，这可能是其改善HFD诱导的肥胖和代谢异常的原因（图S9O-S9Q）。另外，4μ8C逆转了HFD PD-1小鼠iBAT中Ucp1、Cidea、Prdm16、Cox8b和Ppargc1a mRNA水平以及UCP-1、PGC-1α和PPAR-γ蛋白水平的下降（图S9R和S9S），同时恢复了iWAT中UCP-1和PGC-1α的表达下调（图S9T）。在LPS预处理的RAW264.7细胞中重建表达PD-1 T250A或敲减ULK1，然后与3T3-L1脂肪细胞共培养，显著降低了3T3-L1脂肪细胞中UCP-1、PGC-1α和PPAR-γ的表达，而4μ8C处理能逆转该现象（图S9U）。此外，在RAW264.7细胞中重建表达PD-1 T250A或PD-1 3mut，显著增强了Xbp1剪接、促炎细胞因子Il1b、Il6、Tnf和Ccl2的mRNA表达水平，并减少了RIDD靶基因（Col6a1、Bloc1和Pdgfrb）的表达，而上述现象在AMG18（抑制IRE1α的激酶活性）处理后被逆转（图S9V和S9W）。研究人员将RAW264.7细胞与3T3-L1脂肪细胞共培养，结果显示，在LPS预处理的RAW264.7细胞中重建表达PD-1 T250A或PD-1 3mut，显著降低了3T3-L1脂肪细胞中UCP-1、PGC-1α和PPAR-γ的表达，而上述基因表达同样被AMG18处理所逆转（图S9X）。

由于4μ8C不是IRE1α的特异性抑制剂，使用过程中可能存在潜在的脱靶效应。因此，研究人员构建了髓系细胞特异性PD-1和IRE1α双敲除小鼠模型（PD-1/IRE1α DKO；图S10A、S10J和S10K展示了基因分型和敲除效率），以探究IRE1α在加剧HFD诱导的肥胖和肥胖相关代谢紊乱中的重要作用。髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠中HFD诱导的表型被PD-1/IRE1α双敲除所逆转，包括体重和肥胖增加、葡萄糖耐量受损和胰岛素抵抗、能量消耗减少以及iBAT和iWAT中产热基因和蛋白表达下降（图7A-7P和S10B-S10E），而不影响食物摄入。同时还逆转了肝脂肪变性、肝脏脂质堆积以及血脂异常（图S10F-S10I）。在髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠BMDM中，HFD诱导的IRE1α激活以及iWAT促炎细胞因子上调，也被PD-1/IRE1α双敲除逆转（图S10J-S10L）。上述发现表明，IRE1α激活相关的促炎细胞因子产生，与巨噬细胞PD-1阻断和/或PD-1缺失诱导的代谢紊乱相关联。

图7.IRE1α敲除改善髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠中HFD诱导的代谢紊乱

图S9.在髓系细胞特异性PD-1敲除小鼠中，4μ8C通过恢复降低的能量消耗改善HFD诱导的肥胖及代谢紊乱现象

图S10.IRE1α敲除可缓解HFD诱导的骨髓细胞特异性PD-1敲除小鼠的肥胖及代谢紊乱

总结

本文中，研究人员证实，PD-1抗体可靶向巨噬细胞PD-1，降低小鼠能量消耗并加剧HFD诱导的肥胖及代谢综合征。机制上，LPS以mTOR依赖的方式激活ULK1，活化的ULK1通过磷酸化PD-1 T250位点来破坏FBXO38与PD-1的结合，从而抑制FBXO38介导的PD-1泛素化降解。同时磷酸化的PD-1与IRE1α相互作用，抑制IRE1α自磷酸化，进而抑制ER应激介导的炎症反应。而抑制IRE1α可缓解巨噬细胞特异性PD-1敲除小鼠能量消耗的降低，以及HFD诱导的代谢紊乱。本文揭示了巨噬细胞PD-1在免疫检查点阻断、能量消耗与代谢功能障碍交叉点的关键作用，为防治ICI治疗及HFD相关代谢疾病提供了新思路。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413125004930?via%3Dihub