代谢学人

Cell Metabolism：过度运动，大脑悄悄受伤

撰文 | 吴世林 陈芳芳 胡敏 张俊 武霞 郭明伟

编辑 | 孟美瑶

校对 | 胡敏

背景介绍

运动已被公认为是预防疾病、促进健康的有效策略，包括对大脑结构和功能的益处，可缓解与年龄相关的认知功能下降。然而，运动与健康之间的剂量反应关系呈现倒J型曲线：过度负荷可能导致肌肉疲劳和心血管功能障碍等不良后果。值得注意的是，多项临床研究表明过度运动与认知衰退存在关联，但其基础机制仍不明确。

突触丧失是认知衰退的早期病理特征。鉴于突触巨大的能量需求，其依赖局部线粒体来生成ATP。KIF5介导的线粒体运输及其通过SNPH实现的突触锚定，对维持这种能量供应至关重要。任一过程的紊乱都会导致能量不足，进而损害突触功能并加剧认知衰退。然而，外源性因素如何影响突触前线粒体的动态变化仍不明确。

扩展阅读：KIF5介导的线粒体轴突运输与突触锚定机制

KIF5是一种微管依赖性马达蛋白，利用ATP水解产生的能量，沿微管从神经元胞体向轴突末梢进行顺向运输，将线粒体等货物拖运至远端突触。线粒体本身并不直接连接KIF5。连接由适配器蛋白复合物完成，主要是Miro（位于线粒体外膜的钙敏感蛋白）和TRAK（衔接蛋白）。TRAK同时结合KIF5和Miro，形成“KIF5–TRAK–Miro–线粒体”的桥梁，确保线粒体被正确装载并启动运输。

当线粒体被运输至接近突触活性区域时，需要从移动状态转变为稳定停留，以确保局部ATP供应。突触锚定蛋白SNPH在此起关键作用。SNPH能直接与微管结合，并同时与线粒体上的适配器（如Miro/TRAK复合物）或线粒体外膜蛋白相互作用。当线粒体到达需要驻留的位置时，SNPH的功能类似于“刹车”，通过与微管及线粒体的多重结合，对抗KIF5的马达动力，将线粒体稳定地锚定在特定的微管片段上，使其停靠在突触附近。

本研究发现的病理机制破坏了上述正常过程。otMDVs表面的PAF蛋白冒充线粒体，与SNPH异常结合。这相当于占据了有限的突触锚定位点，导致内源性线粒体无法正常锚定，即使被运输也无法有效驻留供能。otMDVs释放的mtDNA通过激活cGAS-STING通路，下调KIF5的表达。相当于减少了运输线粒体数量，导致线粒体从源头上就无法被有效运抵远端的突触。

总结而言，otMDVs通过PAF-SNPH和mtDNA-cGAS-STING-KIF5轴破坏线粒体的运输，最终导致突触严重的能量供应危机和认知功能损伤。

参考文献：

[1] Douglas R. Green, et al. Cell Metabolism.

线粒体衍生的囊泡（MDVs，Mitochondria-derived vesicles）是一种细胞外囊泡，其选择性地包装线粒体碎片而非完整的线粒体。它们在细胞通讯和线粒体质量控制中的作用，正日益受到多学科领域研究的关注。研究表明，来自应激脂肪细胞的MDVs可转移受损线粒体组分，从而激活心脏抗氧化防御机制。在癌症中，MDVs通过运输线粒体信号来影响影响肿瘤生长及免疫应答，这些信号调控细胞代谢与应激反应。在神经系统中，关于MDVs的研究正蓬勃发展，越来越多证据支持其对神经元健康的重要性。然而，外周组织（如肌肉）来源的MDVs对海马体的潜在影响仍处于探索阶段。

扩展阅读：MDVs研究进展

1.激活心脏抗氧化防御机制：在缺氧条件下，MDVs的产生与心肌细胞凋亡呈负相关；外源性MDVs抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡；MDVs介导的对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的保护是通过线粒体途径中的Bcl-2相互作用完成的；

2.MDVs不仅可以维持线粒体健康，而且对肿瘤进展也有重大影响。MDVs在氧化应激下选择性地封装和运输受损的线粒体蛋白，减少线粒体损伤对细胞的不利影响，从而可能促进肿瘤细胞的存活和增殖。此外，已经表明，细胞经历轻度应激后，MDVs的数量在2-6小时内显著增加，而线粒体自噬（一种清除受损线粒体的过程）发生在12-24小时后。这表明MDVs在细胞的早期应激反应中起着关键作用。此外，MDVs在细胞间通讯中也起着重要作用，特别是在肿瘤微环境中。它们可以携带和传递各种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质，这些分子调节肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。这种细胞间通讯可能促进肿瘤扩散和转移，使MDVs成为潜在的治疗靶点。

3.诱发神经退行性疾病的早期炎症：多种证据表明线粒体功能障碍与线粒体DAMP（mtDAMP）（例如线粒体DNA、线粒体转录因子A（TFAM）和心磷脂等）介导的炎症有关。线粒体衍生囊泡（MDVs）是线粒体轻度损伤后产生的细胞外囊泡的一种亚型，与多囊泡体融合后作为细胞外囊泡释放到细胞外空间。MDVs特别富含mtDAMP，它可以诱导免疫反应和促炎细胞因子的释放，这可能促进神经退行性疾病的早期炎症。

参考文献：

[1] Binghu Li,et al. Frontiers in Cell and Developmental Biology.

[2] Xueqiang Peng, et al. Clinical and Translational Medicine.

[3] Cláudia M. Deus, et al.  Cells.

在此研究中，研究人员发现了一种新型肌源性囊泡（otMDVs），其特征为线粒体DNA（mtDNA）水平升高及表面表达PCNA相关因子（PAF）（小编注： PCNA（Proliferating Cell Nuclear Antigen，增殖细胞核抗原）是一个在细胞核内形成的环状三聚体蛋白，像一个“滑动夹”或“工作平台”。在DNA复制时，它会像戒指一样套在DNA双螺旋上，并将DNA聚合酶（负责合成新DNA链的机器）牢牢地锚定在DNA模板上，从而极大地提高DNA复制的效率和持续性。DNA损伤修复的调度中心：当DNA受损时，PCNA 会被修饰（如泛素化），成为招募各种DNA修复蛋白（如参与错配修复、核苷酸切除修复的酶）的平台，协调修复过程。细胞周期与表观遗传的调控节点：PCNA 还参与协调DNA复制与染色质组装、细胞周期检查点调控等过程。而PAF的核心特性是与PCNA直接、高亲和力地相互作用，通过与PCNA结合，将自己锚定到DNA复制和损伤修复的前沿，从而发挥多重调控作用。），并受转录因子5（ATF5）的乳酰化调控，该囊泡会引发过度剧烈运动导致的认知功能障碍。当otMDVs迁移至海马神经元后，通过激活mtDNA-cGAS-STING通路并利用PAF占据锚定位点，引发突触丧失。该效应可被PAF中和抗体加以抑制。这些发现强调了制定均衡运动方案，以减轻其对脑健康潜在危害的迫切需求。

敲黑板啦！

1. 过度剧烈运动会导致认知功能障碍；

2. ATF5乳酰化促进过度剧烈运动期间otMDVs的分泌；

3. otMDVs的特征在于其表面标志物PAF富集及线粒体DNA含量增加；

4. otMDVs通过占据线粒体锚定位点诱导突触能量缺失。

 研究结果

1、英国生物库数据揭示剧烈运动与认知功能障碍呈J型关联

为探究运动量与认知功能的关系，研究人员采用代谢当量（METs，metabolic equivalents）量化身体活动量，分析了英国生物库的横断面数据（小编注：代谢当量（Metabolic Equivalent of Task，MET）是衡量身体活动强度的常用生理学指标。它的定义是：1 MET = 静息状态下的能量消耗率。具体指安静坐着时，每分钟、每公斤体重消耗的氧气量（约3.5毫升/分钟/公斤）。这相当于静息代谢率，可作为能量消耗的“基准单位”。简单理解为，MET值表示某项活动的强度是静息状态的多少倍。）。根据纳入与排除标准，最终纳入316,678名数据完整的参与者，将其按活动水平分为五组，并采用多种认知指标进行评估（图S1A）。在调整年龄、性别、教育背景、BMI等因素后，研究人员发现了一种矛盾性关联：身体活动水平越高，认知表现越差。值得注意的是，最高活动水平五分位组（Q5）在所有认知领域的标准化得分均显著低于总体均值（图1A）。

研究人员进一步评估了不同MET水平人群在长达13.7年（中位数）的随访期间（共5,338例认知障碍病例及21,575例死亡）的长期认知结局。值得注意的是，总体身体活动量与认知障碍风险呈J型关联，最佳剂量为3,972MET-min/week（HR =0.73；95%置信区间[CI]：0.68–0.78；21.76%的参与者高于最低值）（图1B）（小编注：本文当中使用的代谢当量单位为MET-min/week，它是一个用来量化身体活动总能量消耗的复合单位。将一周内所有活动的MET-min值相加，得到每周总活动量。高强度活动时间=高强度活动MET-min/周÷某项高强度活动的MET值，以最常见的“跑步”为例，1216 MET-min/week则相当于每周进行约152分钟的快走（平均每天约22分钟）。）。中等强度活动在低于最低阈值时未显著增加风险（13.60%参与者高于最低阈值）（图1C），而剧烈活动在1,216 MET-min/week时达到最低风险点（HR=0.73；95% CI：0.68–0.79；17.68%参与者高于最低阈值）（图1D）。按性别或年龄分层的亚组分析（仅限剧烈活动），均显示一致的J型关联模式。性别特异性最低点分别为女性1,013 MET-min/week、男性1,368 MET-min/week（图S1B和S1C）。年龄特异性最低值（65岁为分界点）显示：老年人1165 MET-min/week，年轻成年人1418 MET-min/week（图S1D和S1E）。尽管最佳阈值存在差异,这些发现仍证实了各亚组间存在强有力的J型关系。

图1 | 过度训练导致海马体突触缺陷和认知功能障碍

图S1 | 过度剧烈运动导致认知下降

2、过度剧烈运动导致小鼠海马体突触功能缺损及认知功能障碍

基于这些发现，研究人员利用基于MET的运动量化方法，在小鼠模型中探讨了运动与认知功能的关系。研究人员让小鼠接受了不同持续时间的中等强度或高强度训练。中等强度组在代谢当量超过281 MET-min/week时呈现出认知益处（图S1F和S1G）。相反，高强度组初期虽有认知能力改善，但当代谢当量超过阈值后，这些改善转为不良影响，且这种损害持续存在（图S1H和S1I）。这种J型曲线表明，当运动强度超过特定代谢当量阈值时会使运动的有益效果转为有害影响。在后续机制研究中，研究人员将中等强度运动定义为281-563 MET-min/week的活动，过度剧烈运动定义为超过450 MET-min/week的活动。

如流程图所示，所有组别均经历为期12周的干预期，随后进入标准化的1周洗脱期，再进行行为评估（图1E）。随后，研究人员进行了行为测试以评估认知功能，包括新物体识别测试（NORT，novel object recognition test，评估非空间学习记忆）和莫里斯水迷宫（MWM，Morris water maze，评估空间学习记忆）。在洗脱期后，各组在MWM和NORT中观察到的肌肉运动活动参数（速度和距离）以及疲劳程度（通过初始收缩力与后续每次收缩力的百分比差异量化）均未见显著差异（图S1J–S1N）。这些发现证实，在认知评估之前，运动的急性效应已被缓解。在MWM测试中，相较于中等运动组和对照组，过度运动组的小鼠在训练阶段（第1至5天）表现出更长的逃逸潜伏期（图1F），且在后续探测试验中平台穿越次数减少，目标象限停留时间缩短（第6天），这表明过度剧烈运动同时损害了学习与记忆能力（图1G–1I）。此外，过度运动小鼠在NORT试验中探索新物体的时间显著少于对照组和适度运动组，表明其非空间学习能力下降（图1J）。

认知障碍与海马区突触丧失相关。研究人员进一步评估了海马区树突棘的密度与形态。高尔基染色显示，过度运动小鼠海马神经元树突棘密度显著降低，蘑菇状棘与细棘比例均减少（图1K和1L）（小编注：蘑菇状棘：大而稳定，通常代表成熟、强效的突触连接，是长期记忆的物理存储位点。其比例减少意味着稳定的记忆基础被削弱。细长型棘：小而动态，通常代表可塑性强、正在形成或调整中的突触，与学习过程和记忆形成密切相关。其比例减少意味着大脑建立新连接、学习新事物的能力下降。蘑菇型、细棘、丝状棘及短粗棘的典型形态如下图，从海马切片的高尔基染色实验中发现，除了具有清晰头部和颈部的蘑菇状棘和细棘外，还观察到许多短粗棘突(stubby spines )和丝状棘突(filopodia spines)（无明显头部）。

短粗棘突通常具有突触的主要特征，包括突后密度，但缺乏颈部。相比之下，细长棘突和蘑菇棘突具有明显的颈部和更宽的头部。大型棘突通常持续数周至数月，形成强效突触；而小型棘突多为短暂存在，形成较弱突触。基于这些特性，研究人员推测丝状棘突或短粗棘突则体现神经回路适应性重塑的能力（即学习棘突）参考文献：Murakami G,et al. J Neuroendocrinol. )

此外，研究人员通过检测海马区中突触前标记物突触素和突触后标记物PSD95的表达量，发现两者均呈下降趋势（图1M）。透射电子显微镜（TEM，transmission electron microscopy）观察结果进一步证实，过度剧烈运动会缩短神经元突触中的突触后致密区（PSD）的长度（图1N和1O）。这些突触结构损伤与过度剧烈运动诱发的认知衰退现象相吻合。

综上，这些结果共同揭示了过度运动对突触功能和认知功能的损害作用。

3、肌肉来源的MDVs导致突触功能障碍与认知损伤

骨骼肌是维持身体运动的关键器官。此外，肌肉线粒体在运动过程中会发生显著重塑。透射电镜显示，在接受过度剧烈运动的小鼠中，肌肉线粒体出现了空泡样改变和肿胀（图S2A）。值得注意的是，从这些过度运动小鼠肌肉中分离出的线粒体显示出芽状结构增多（图2A和2B）。最新研究表明，在多种刺激下，线粒体可产生并释放MDVs，进而调控其他器官功能。为验证过度剧烈运动是否增强MDVs分泌，研究人员采用Mito Tracker阳性小胞外囊泡（sEVs）检测血浆中总MDVs水平，结果发现过度运动小鼠的总MDVs水平较对照组显著升高（图2C和2D）。

随后研究人员采用已发表的方案分离出MDVs，结果发现这些囊泡富含HSP60和VDAC等线粒体标志物（图S2B）。纳米粒子追踪分析（NTA，Nanoparticle tracking analysis）和TEM进一步揭示，分离出的MDVs直径约100nm，呈杯状形态（图S2C和S2D）。流式细胞术显示分离的MDVs纯度约为90.4%（图S2E）。与典型EVs不同，MDVs携带线粒体蛋白（含HSP60和VDAC）、具有更高mtDNA含量及增强的ATP生成能力（图S2F-S2H）。

在探究肌肉MDVs是否介导认知衰退前，研究人员首先确定了其分布情况。他们分别从对照组小鼠和过度运动小鼠中分离出血浆MDVs，分别命名为conMDVs和otMDVs。将混合的conMDVs和otMDVs通过静脉注射至受体野生型（WT）小鼠体内，通过体内成像系统（IVIS）观察MDVs的分布情况。研究人员发现，DiR探针标记的MDVs迁移至大脑区域（图S2I）。此外，PKH67标记的MDVs被发现分布于海马区（图S2J），主要定位于神经元（标记物：NeuN），而非星形胶质细胞（标记物：Gfap）和小胶质细胞（标记物：Iba1）（图S2K和S2L）。

为进一步证实MDVs可穿透血脑屏障（BBB，blood-brain barrier），研究人员建立了体外BBB模型，并注入PKH67标记的MDVs。从上下室培养基中分离出的标记MDVs经NTA和TEM检测，确认其尺寸分布正常且结构完整（图S2M）。既往研究指出，sEVs通过转胞吞作用或紧密连接穿透BBB。为阐明MDVs穿越血脑屏障的机制，将PKH67标记的MDVs引入基于Transwell的体外血脑屏障模型（小编注：基于Transwell的体外血脑屏障模型是一种利用Transwell培养装置模拟血脑屏障结构和功能的经典细胞培养模型。它通过在多孔膜上培养脑微血管内皮细胞，重现血脑屏障的关键特性，是研究物质穿透性、细胞间相互作用及疾病机制的重要工具。在本文中，为探究MDVs横穿血脑屏障的机制，研究人员采用三细胞共培养系统构建了体外血脑屏障模型。原代脑微血管内皮细胞（BMECs）和星形胶质细胞被接种在Transwell插入件（孔径0.4微米）的相对两侧，下室未接种任何细胞。将PKH67荧光染料标记的MDVs注入体外血脑屏障模型。经24小时孵育后，对PKH67荧光信号进行定量分析。此外，研究人员对来自两个腔室的分离的MDVs均进行了NTA分析和TEM检测，以验证MDVs的完整性。）。对下室的荧光强度分析显示，约29%的标记MDVs成功穿越血脑屏障（图S2N）。然而，使用内吞抑制剂（包括氯丙嗪——抑制网格蛋白介导的内吞作用；dynasore——同时抑制网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用）处理后，下室的MDVs数量显著减少。这些发现表明内吞作用介导了MDVs穿过血脑屏障的过程（图S2N）。此外，EGTA诱导的紧密连接破坏增加了MDVs穿透率，表明其亦可通过旁细胞通道渗漏进入（图S2O）（小编注：EGTA是一种常用的金属离子螯合剂，对二价阳离子有强结合力，尤其是对Ca²⁺的亲和力极高。血脑屏障内皮细胞之间的紧密连接的形成和维持高度依赖于细胞外Ca²⁺。Ca²⁺是钙黏蛋白等细胞黏附分子发挥功能所必需的。当在Transwell模型的血管腔侧（上室）加入EGTA后，它会强力螯合细胞周围的Ca²⁺，导致钙黏蛋白依赖的细胞间黏附被破坏，紧密连接“打开”，形成临时的“旁细胞通道”）。这些发现表明MDVs通过转胞吞作用和旁细胞通道两种途径穿越BBB。为进一步验证MDVs在体内的血脑屏障穿透能力，研究人员对MDVs进行荧光标记后，分别注射至对照组小鼠和过度运动组小鼠体内。对照组脑内与外周荧光强度比值约为12%，而过度运动组则达25%，表明MDVs可穿越血脑屏障，而过度运动会增强其通透性（图S2P）。

为探究MDVs对认知功能的影响，研究人员采用每周三次注射的方式持续给药8周。经过8周治疗后，研究人员通过认知功能行为测试发现，otMDVs治疗诱导了认知衰退（图2E）。此外，通过高尔基染色及突触标记物检测证实，otMDVs破坏了突触密度、形态及突触标记物表达（图2F、2G和S2Q）。研究人员还发现otMDVs导致海马区神经元突触的突触后致密区长度缩短（图2H和2I）。这些发现表明otMDVs破坏突触结构并导致认知功能衰退。

PINK1通过促进受损线粒体的包装过程，在MDVs释放中发挥关键作用，该过程对细胞应对线粒体应激至关重要。为进一步验证otMDVs是否介导过度剧烈运动相关的突触功能障碍，研究人员通过肌肉注射AAV-shPink1抑制过度运动小鼠的肌肉MDVs释放。与先前的研究结果一致，持续过度运动不仅会增加MDVs分泌（图2J和2K），还伴随认知损伤和突触丧失（图2L–2P）。然而，抑制肌肉MDVs分泌后，可以恢复受损的认知功能和突触功能（图2L–2P）。此外，在抑制otMDVs分泌后，研究人员检测到突触素和PSD95水平均有所增加（图S2R）。

综合而言，这些结果表明肌肉MDVs的分泌介导了过度剧烈运动引发的突触功能紊乱。

扩展阅读：MDVs与线粒体自噬

PINK1作为线粒体传感器，可以感知线粒体的异常状态，当线粒体发生异常的时候PINK1通过磷酸化泛素连接酶Parkin及泛素分子，触发泛素化与磷酸化的正反馈循环，最终诱导线粒体自噬。有研究人员采用低剂量线粒体复合物III抑制剂抗霉素A（该药物通常以更高浓度急性诱导线粒体自噬）进行的动力学分析显示，MDVs爆发依赖于PINK1/Parkin通路，且该通路将MDVs运送至晚期内体过程独立于自噬机制。在这些实验中，线粒体自噬仅在抗霉A处理12-24小时后出现，而线粒体囊泡的峰值形成则发生在1-3小时内。添加大麻素时也观察到类似证据，表明线粒体囊泡作为应激的早期反应，其形成早于线粒体自噬且依赖于PINK1和Parkin。低剂量一氧化碳处理少突胶质细胞前体细胞时，生成的线粒体损伤囊泡发挥预适应机制，保护细胞免受一氧化碳毒性损害。综上表明线粒体损伤囊泡通过清除受损或氧化物质，在早期重塑线粒体蛋白组。从动力学角度看，低剂量抗霉A或大麻素处理表明线粒体囊泡形成先于线粒体自噬，这暗示线粒体的积累损伤必须足够广泛，才能使所有输入通道积累PINK1蛋白，并放大Parkin蛋白的泛素化反应以招募自噬适配器，使受损线粒体被自噬降解。另一方面Miro是一种线粒体外膜（OMM，outer mitochondrial membrane）蛋白，能将线粒体锚定于运动蛋白和微管上。线粒体去极化使PINK1在线粒体表面稳定，促进其与Miro相互作用，并导致PINK1磷酸化Miro的Ser156位点。随后Parkin与Miro相互作用并可能引发泛素化，促使Miro脱离膜结构并被蛋白酶体降解，从而释放出milton和动力蛋白。并且多项研究证实：Parkin依赖性泛素化修饰及蛋白酶体降解MIRO是阻断线粒体运动并启动线粒体自噬的必要条件。MIRO缺失的次生效应将导致MDVs形成受阻，这可能促成向线粒体自噬的转换。

这形成了一种可调式调节机制：MDVs生成能力取决于功能障碍程度，且可能与线粒体微管蛋白状态相关。

参考文献：

[1] Tim König, et al. Cell Metabolism.

[2] Xinnan Wang, et al. Cell.

图2 | 肌肉线粒体来源囊泡（MDVs）导致突触功能障碍和认知障碍

图S2 | otMDVs 迁移至海马体并影响认知

4、OtMDVs具有表面标记物PAF的特征，且mtDNA水平显著富集

研究人员对肌肉来源的conMDVs和otMDVs进行蛋白质组学分析，以鉴定关键调控因子。在otMDVs所有上调蛋白质中，PAF表达水平最高（图S3A）（小编注：PAF，Proliferating Cell Nuclear Antigen-Associated Factor，增殖细胞核抗原相关因子。PAF 的核心功能是作为 PCNA（增殖细胞核抗原）的相作与调控因子。通过与PCNA的相互作用，PAF参与调控DNA复制进程和细胞周期进展，影响细胞增殖。在DNA受损时，PAF被招募到损伤部位，协助协调DNA修复过程。在这项过度运动与认知功能的研究中，PAF展现了一个全新的、关键的细胞外功能：1、作为“坏包裹”的表面标志物：在由过度运动肌肉产生的特殊囊泡otMDVs上，PAF高表达于其表面，成为识别这种有害囊泡的特异性“标签”；2、介导“占座”破坏：otMDVs表面的PAF蛋白，能够与大脑神经元突触处的 SNPH 蛋白（一种线粒体锚定蛋白）特异性结合。这使得otMDVs能够非法占据本应由功能性线粒体停靠的“锚定位点”，从而剥夺突触的能量供应，导致其功能受损和丧失。）。PAF作为PCNA相关因子，此前已被证实参与细胞增殖、凋亡及细胞周期调控。研究还表明其定位于线粒体。因此研究人员选择对PAF进行深入研究。Western blotting验证了otMDVs中（图S3B）和过度运动小鼠肌肉组织中PAF水平的升高（图S3B和S3C）。电子显微镜显示MDVs从线粒体结构中出芽（图3A）。流式细胞术进一步证实，过度运动小鼠肌肉中分离出的PAF⁺ MDVs数量增加（图S3D和S3E）。与肌肉来源的PAF⁺ MDVs升高一致，过度运动小鼠的血浆中PAF⁺ MDVs也显著增多，表明PAF可作为otMDVs的潜在标记物（图3B和3C）。

鉴于MDVs内富含mtDNA，研究人员比较了conMDVs与otMDVs的DNA含量，发现PKH67标记的otMDVs中DNA水平显著高于PKH67标记的conMDVs（图S3F和S3G）。通过RT-qPCR和PicoGreen染色法均证实，PAF⁺ MDVs的mtDNA含量高于PAF⁻ MDVs（图S3H和S3I）（小编注：PicoGreen染色法是一种高灵敏度、特异性的定量双链DNA（dsDNA）的荧光检测技术。可用于定量mtDNA，细胞凋亡/坏死检测等等）。MDVs表现出线粒体呼吸活性。研究人员通过Seahorse能量代谢分析仪测定MDVs的氧消耗量，结果显示otMDVs的基础呼吸、ATP生成量及最大呼吸量均显著低于conMDVs（图S3J和S3K）。ATP检测进一步证实otMDVs存在ATP生成缺陷，表明其ATP生成能力弱于conMDVs（图S3L）。

图3 | 以表面标记物PAF和富含mtDNA为特征的otMDVs受ATF5乳酰化修饰调控

图S3 | 肌肉乳酸刺激 PAF⁺ MDVs 的分泌

5、肌肉中乳酸过量诱导的otMDVs分泌损害认知功能

研究人员进一步探究了促进otMDVs分泌的机制。在过度剧烈运动期间，肌肉组织会发生多种变化，包括机械负荷改变、下丘脑-垂体轴激活、炎症反应及乳酸积累。结果显示循环皮质醇水平无明显变化，但过度运动组脑源性神经营养因子（BDNF）水平有所升高（图S3M和S3N）。鉴于BDNF对认知功能有益，这排除其对认知功能的损害效应。此外，过度剧烈运动导致促炎细胞因子轻度升高，乳酸水平显著上升，肌肉乳酸浓度亦明显增加（图S3O、S3P及3E）。值得注意的是，仅乳酸（而非其他因子）能特异性增加PAF⁺ MDV的水平（图S3Q和S3R），这促使研究人员进一步探究其在PAF⁺ MDVs分泌中的作用机制。通过C2C12细胞与神经元共培养体系，研究人员证实乳酸刺激的C2C12细胞会增加PAF⁺ MDVs释放，并降低神经元突触密度（尤其是蘑菇样棘和细棘）（图S3S–S3V）。当通过Pink1敲低抑制otMDVs分泌后，这些有害效应得到显著缓解（图S3S–S3V）。

这些发现通过体内实验得到进一步验证。值得注意的是，尽管不同时长的高强度运动均会导致肌肉乳酸大量升高，但短时剧烈运动（15-45min）仅导致乳酸暂时性积累，未引发显著的PAF⁺ MDVs释放（图S3W和S3X）。相反，持续性剧烈运动（超过60min）会导致乳酸水平持续升高，并伴随显著的PAF⁺ MDVs释放（图S3W和S3X）。为建立不同剂量乳酸与体内PAF⁺ MDVs之间的因果关联，研究人员采用分级乳酸肌肉注射法，并检测注射后肌肉内乳酸浓度。值得注意的是，40 mg/kg乳酸注射量可复现中等强度运动小鼠体内的乳酸水平，而120 mg/kg则可模拟过度运动组的乳酸水平（图S3Y）。因此，研究人员对WT小鼠每日肌肉注射上述浓度的乳酸，持续4周（图3F）。结果发现，高剂量乳酸（120 mg/kg）显著提升了血浆中PAF⁺ MDVs和肌肉来源的PAF⁺ MDVs水平（图3G、3H及S3Z）。此外，与溶剂对照组或低剂量乳酸处理组的小鼠相比，高剂量乳酸处理组小鼠来源的MDVs中mtDNA含量更高（图3I）。

值得注意的是，接受高浓度乳酸肌肉注射的小鼠表现出认知功能下降，具体表现为逃逸潜伏期延长及对新异物体的探索时间减少（图S4A和S4B）。为验证肌肉注射乳酸是否会通过全身扩散影响认知，研究人员通过静脉注射乳酸模拟肌肉注射效应，以达到相同的循环乳酸水平（图S4C和S4D）。值得注意的是，这种血液乳酸升高并未使WT小鼠出现认知功能障碍（图S4E）。为探究循环乳酸是否直接影响认知，研究人员通过尾静脉向WT小鼠注射120 mg/kg乳酸，以模拟过度运动小鼠的循环乳酸水平（图S4F）。乳酸处理显著提升了血浆乳酸水平，但肌肉乳酸水平仅出现轻微上升（图S4G），而PAF⁺ MDVs水平保持不变（图S4H）。此外，为期4周的乳酸处理并未损害认知功能（图S4I）。因此研究人员重点研究了过度运动期间肌肉乳酸对认知功能的影响。

为进一步阐明肌肉乳酸堆积在调节过度运动诱导的认知衰退中的关键作用，研究人员构建了Acta1-CreERT2小鼠与Ldha^flox小鼠。乳酸脱氢酶（LDHA）是调控乳酸生成的关键酶，ACTA1是成熟骨骼肌的标志性分子（小编注：研究人员之所以选择 Acta1-CreERT2而非传统的HSA-Cre或MCK-Cre，核心在于规避发育缺陷并实现精准的时间控制：HSA或MCK驱动的Cre重组酶通常属于组成型表达（Constitutive），会导致Ldha基因在胚胎期或出生早期即被敲除，这不仅可能引发严重的肌肉发育障碍或致死效应，还会迫使机体在发育过程中产生复杂的代谢代偿（如能量代谢方式的重编程），从而干扰对实验结果的解读；相比之下，Acta1-CreERT2属于药物诱导型系统，允许小鼠在完全正常的生理状态下发育成熟，研究者仅需在过度运动实验前通过他莫昔芬（Tamoxifen）给药启动基因敲除，这种设计能确保观察到的表型是源于“运动期间急性缺失LDHA”这一单一变量，而非长期基因缺失带来的发育性或适应性后果）。研究人员将Acta1-CreERT2小鼠与Ldha^flox小鼠进行杂交，成功获得了肌肉特异性Ldha敲除小鼠（Ldha^AKO）（图3J）。Ldha表达下降在Ldha^flox小鼠中得到证实（图S4J和S4K）。随后这些小鼠接受了为期12周的过度运动方案。值得注意的是，过度运动诱导的肌肉和血浆中PAF⁺ MDVs水平升高在Ldha抑制后得到了逆转（图S4L、S4M、3K和3L），同时otMDVs中mtDNA水平降低（图3M）。然而，肌肉特异性Ldha缺失小鼠未能逆转认知衰退（图S4N–S4P）。鉴于LDHA介导关键生物过程，研究人员推测其缺失可能诱发多效性代谢紊乱，从而抵消PAF⁺ MDVs减少带来的有益效应。

综合而言，这些结果表明由肌肉乳酸积累诱导的otMDVs，是过度运动诱导认知障碍的关键调控因子。

图S4 | 肌肉（而非静脉）注射乳酸刺激PAF⁺ MDVs释放和认知衰退

6、otMDVs的特性由ATF5乳酰化调控

乳酰化作为新发现的翻译后修饰，已被证实能调控多种生物过程。研究人员发现过度运动小鼠的肌肉组织中乳酰化修饰显著增强，该现象在乳酸刺激的C2C12细胞中亦有观察（图S5A和S5B）。据此，研究人员推测，某些经历乳酰化修饰的关键因子可能同时促进线粒体PAF⁺ MDVs的生成与分泌。通过乳酸刺激C2C12细胞的乳酰化质谱分析，鉴定出的在所有经乳酰化抗体免疫沉淀的蛋白质中，ATF5已被证实参与多种刺激条件下线粒体稳态的调控（图S5C）。因此，研究人员把研究重点转向了ATF5。

在过度运动小鼠肌肉中ATF5的乳酰化水平升高得到了证实（图3N）。乳酰化质谱分析在ATF5上鉴定出三个乳酰化修饰位点：K214、K215和K220（图S5D）。接下来，研究人员通过构建定点突变体来确定这些乳酰化位点的功能意义。三处位点联合突变（ATF5-3KR）导致ATF5乳酰化水平显著降低，表明这些位点在调控ATF5乳酰化过程中具有关键作用（图3O）。因此研究人员构建了AAV-Atf5^wt和AAV-Atf5^3KR载体，并将其注射至过度运动小鼠的肌肉中（图3P）。结果显示，乳酰化位点的突变显著降低了PAF⁺ MDVs的分泌量（图3Q和3R），同时伴随MDVs内mtDNA含量的减少（图3S）。此外，与注射AAV-Atf5^wt的小鼠相比，注射AAV-Atf5^3KR的小鼠在NORT和MWM测试中均表现出显著缓解过度运动诱导的相关认知功能的衰退（图S5E–S5G）。

研究人员进一步阐明了ATF5在otMDVs内调控PAF和mtDNA的机制。已有研究表明，ATF5是线粒体蛋白酶（包括LONP1和CLPP）的重要转录因子。抑制ATF5成功降低了CLPP的表达水平，但未影响LONP1表达（图S5H和S5I）。此外，抑制CLPP（而非LONP1）显著增强了PAF表达（图S5H和S5I），表明CLPP可能介导ATF5相关的PAF调控。一致的是，Atf5^3KR质粒（而非Atf5^wt质粒）的过表达可有效降低ATF5乳酰化水平并逆转CLPP表达（图S5J）。免疫共沉淀（Co-IP）实验也证实PAF与CLPP之间存在相互作用，表明CLPP可结合PAF并将其降解（图S5K）。这些数据表明，由ATF5乳酰化修饰驱动的CLPP下调，可能是PAF⁺ MDVs增加的原因。为验证这一假设，研究人员进一步向小鼠肌肉注射AAV-shClpp，发现血浆中PAF⁺ MDVs分泌增加，且这些MDVs内的mtDNA水平升高（图S5L–S5P）。

综上所述，这些发现共同揭示了乳酸-ATF5-CLPP轴在调控携带PAF标记的MDVs生成及mtDNA水平中的关键作用。

图S5 | ATF5乳酰化修饰抑制CLPP1，从而维持otMDVs中mtDNA和PAF水平

7、PAF-NAb可缓解突触功能障碍与认知衰退

鉴于PAF作为otMDVs的表面标志物，研究人员构建了特异性靶向PAF的中和抗体（PAF–NAb），以阻断PAF⁺ MDVs向海马区的迁移。首先通过尾静脉向过度运动小鼠注射PAF–NAb，以PBS作为对照组。与PBS处理组相比，PAF–NAb处理组小鼠表现出更优异的认知能力（图4A和S6A）。此外，中和PAF⁺ MDVs可恢复树突棘密度，尤其是细棘和蘑菇状棘（图4B和4C）。同时伴随突触密度提升（图S6B）及神经元突触中突触后PSD长度增加（图4D和4E）。

为探究PAF-NAb能否直接对抗PAF⁺ MDVs的影响，研究人员从过度运动小鼠体内分离出血浆PAF^-或PAF⁺ MDVs，并从对照组小鼠中分离出conMDVs。随后，研究人员用PKH67标记PAF⁺ MDVs，在含有或不含PAF-Nab的条件下进行孵育，再将其输注至WT受体小鼠体内（图4F）。值得注意的是，PAF-NAb的给药显著阻断了PAF⁺ MDVs向海马区的迁移（图S6C和S6D）。研究人员进一步评估了其认知效应。行为测试显示，注射PAF⁺ MDVs的小鼠的表现显著劣于注射PAF^- MDVs的小鼠（图4G和S6E）。PAF⁺ MDVs注射还导致海马区突触和树突功能缺损（图4H、4I、S6F和S6G）。值得注意的是，PAF-NAb治疗能有效缓解PAF⁺ MDVs引发的功能性及结构性损伤（图4H、4I、S6F和S6G）。

这些发现证实了PAF⁺ MDVs在调控认知障碍中的关键作用，并揭示了PAF-NAb在治疗过度运动相关认知紊乱方面的潜在疗效。

图4 | PAF⁺ otMDVs的抑制可缓解突触功能障碍和认知衰退

图S6 | PAF⁺ otMDVs 损害认知功能

 8、肌肉中PAF标记物缺失可缓解突触功能障碍与认知衰退

为进一步验证PAF标记物对MDVs的关键作用，研究人员通过构建肌肉特异性Paf敲除小鼠Acta1^Cre; Paf^flox小鼠（简称Paf^Ako，见图S6H），来抑制肌肉中PAF的表达。实验证实Paf^Ako小鼠肌肉中PAF表达水平显著降低（图S6H）。随后，对Paf^Ako和Paf^flox小鼠进行为期12周的过度剧烈运动训练。PAF缺失并未影响正常状态下肌肉细胞的横截面积（图S6I和S6J）。流式细胞术分析显示，过度运动导致Paf^flox过度运动小鼠循环系统中PAF⁺ MDVs升高，而Paf^Ako小鼠未见此现象（图4J和4K）。因此，研究人员分别收集了以下几种小鼠的肌肉来源的MDVs：Paf^flox过度运动小鼠（简称conMDVs）、过度运动的Paf^flox小鼠（称为otMDVs）以及过度运动的Paf^Ako小鼠（称为otMDVs^PAF-），并通过尾静脉将它们输注至受体小鼠体内。给药8周后，otMDVs处理组认知功能受损（图4L），其树突和突触密度较conMDVs处理组显著降低（图4M、4N及补充图S6K–S6M）。值得注意的是，接受otMDVs^PAF-治疗的小鼠相比接受otMDVs治疗的小鼠，其不良反应得到缓解（图4M、4N及补充图S6K–S6M）。

这些发现证实了PAF在otMDVs诱导认知障碍过程中发挥着根本性作用。

9、表面标记物PAF与SNPH结合，介导otMDVs突触占据，并导致能量亏缺

为探究PAF标记物在otMDVs上的必要性，研究人员分别用conMDVs、otMDVs及otMDVs^PAF-处理海马原代神经元。值得注意的是，与conMDVs相比，otMDVs处理导致树突密度降低，而otMDVs^PAF-处理则部分逆转了突触丧失（图5A和5B）。研究人员通过活细胞成像技术测量海马神经元突触中的ATP水平。结果显示，otMDVs和otMDVs^PAF-处理组的ATP水平均低于conMDVs组（图5C和5D）。但与otMDVs组相比，otMDVs^PAF-部分缓解了ATP的缺失（图5C和5D）。此外，与conMDVs或otMDVs^PAF-相比，更多PKH67标记的otMDVs分布于突触区域（图5E和5F）。由此研究人员推断，表面标记物PAF对otMDVs占据突触具有不可替代的作用。

SNPH已被鉴定为一种“静态锚定蛋白”，能将轴突线粒体锚定于突触前末梢附近微管。为明确PAF是否通过与SNPH的相互作用介导突触MDV的占据，研究人员通过免疫沉淀（IP）实验检测HT22细胞中PAF与SNPH的结合，结果表明两者存在相互作用（图5G）。此外，研究人员将转染His-SNPH质粒的HT22细胞裂解液与PAF⁺或PAF⁻ otMDVs裂解液共孵育。结果发现PAF⁺ otMDVs处理组中，PAF可被抗His抗体沉淀（图5H）。然而，SNPH并未与PAF⁻ otMDVs发生相互作用（图5H）。研究人员还观察到PAF以otMDVs剂量依赖性方式与SNPH结合（图S7A）。免疫荧光分析显示otMDVs与SNPH存在共定位现象，而在otMDVs^PAF-组中该现象显著减少（图5I和5J）。

扩展阅读：突触线粒体功能受运输与锚定调控

轴突中线粒体存在“运动”和“静止”两种状态，其动态平衡由运输马达-适配体与锚定蛋白协同调控，以响应神经元的活动与能量状态，从而确保线粒体被精准定位在像突触这样的高能耗区域。运动状态：驱动蛋白-1（Kinesin-1, KIF5）负责将线粒体从细胞体向轴突末端顺行运输，细胞质动力蛋白（Cytoplasmic Dynein）则负责将其向细胞体逆行运输。适配器复合物主要由线粒体Rho GTP酶（Mitochondrial Rho GTPase, MIRO1/2）和运输驱动蛋白结合蛋白(Trafficking Kinesin-Binding Protein, TRAK1/2)组成。它们像“挂钩”一样，一端连接在线粒体外膜上，另一端连接马达蛋白，将马达装载到线粒体上，是启动运输的关键。静止状态：突触锚定蛋白（Syntaphilin, SNPH）是轴突线粒体的特异性“刹车”和“锚”。它通过其微管结合域将线粒体牢牢固定在轴突的骨架上。当SNPH水平高时（如成熟神经元），大部分线粒体被锚定，处于静止状态。

“运输”确保了线粒体能够被递送到轴突各处，而“锚定”则确保它们能够被稳定地保留在需要的地方，如突触前终端。下图展示了这两种力量之间的平衡如何决定线粒体的最终位置。这一精密调控机制的紊乱，将直接导致突触能量供应不足，被认为是多种神经退行性疾病和脑损伤后再生失败的核心环节之一。因此，干预这一平衡（如敲除Snph以增强运输）已成为一种有前景的治疗策略。

参考文献：

[1] Cheng XT, et al. Neuron

扩展阅读：MDVs的生成、清除和功能

线粒体来源囊泡（MDVs）是一种进化保守的、由线粒体产生的特化信号载体。其核心功能在于将选定的线粒体货物（蛋白质、代谢物、mtDNA）打包并精准递送至特定目的地，从而在细胞内外传递代谢、应激和免疫信号。

MDVs生成过程遵循“启动-管状化-分裂”三步模型，具有高度选择性。启动与选择：由特定信号触发。液泡分选蛋白35（Vacuolar protein sorting 35, VPS35）及其逆向运输复合体（Retromer）识别货物，导向过氧化物酶体。PTEN诱导激酶1/E3泛素连接酶Parkin（PTEN-induced kinase 1/E3 ubiquitin ligase Parkin, PINK1/Parkin）通路响应氧化应激。炎症信号则募集分选连接蛋白9（Sorting nexin 9, SNX9）和RAS相关蛋白RAB9（RAS-related protein RAB9, RAB9）。管状化与牵引：线粒体 Rho GTP酶1/2（Mitochondrial Rho GTPase 1/2, MIRO1/2）作为核心，连接微管马达，将选定货物区域拉伸出管状结构。分裂：由线粒体分裂核心蛋白动力相关蛋白1（Dynamin-related protein 1, DRP1）及其受体执行最终切割。

生成的MDVs会被定向运输，首先是递送至过氧化物酶体，参与其生物合成。其次，递送至内溶酶体/吞噬体，用于降解或信号启动。最后是被包装进细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）并分泌至细胞外，进行远程通讯。

在功能上，MDVs参与细胞内信号与代谢重塑。1、选择性移除损伤组分（如氧化蛋白复合物），维持线粒体稳态。2、通过移除特定载体直接改变代谢。例如，在衰老的间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）中，MDVs选择性移除线粒体柠檬酸载体（Mitochondrial citrate carrier, CiC/SLC25A1），导致胞质乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）耗竭，影响表观遗传和分化能力。

MDVs通过EVs参与细胞间通讯。1、应激脂肪细胞释放的含线粒体蛋白的EVs被心肌细胞摄取，可保护心脏抵抗缺血/再灌注损伤。棕色脂肪细胞释放的EVs需由巨噬细胞清除，以维持正常产热。2、炎症下，MDVs可将线粒体抗原递送至主要组织相容性复合体I类分子（MHC-I）呈递途径，激活CD8阳性T细胞（CD8⁺ T cells）。含线粒体DNA（mtDNA）的MDVs进入胞质可激活cGAS-STING，诱发先天免疫反应。

MDVs来源的EVs能通过循环系统进行远程调控（跨组织信号传递）。1、癌细胞释放的含mtDNA的EVs可激活远端细胞内的Toll样受体9（Toll-like receptor 9, TLR9），促进肿瘤迁移、侵袭和免疫逃逸。2、肠道感染可能通过MDVs途径引发针对线粒体抗原的自身免疫，远程攻击大脑多巴胺能神经元，这与帕金森病模型相关。

参考文献：

[1] König T, et al. Cell Metabolism.

随后，研究人员同时用conMDVs、otMDVs及含PAF-NAb的otMDVs处理海马神经元。值得注意的是，PAF-NAb显著降低了otMDVs在突触的占据率，并逆转了otMDVs诱导的海马线粒体异常分布（图5K、5L、S7B和S7C），进一步改善了突触中ATP缺乏状态（图5M和5N）。此外，PAF-NAb可修复突触缺陷，并逆转otMDVs导致的树突棘形态和密度损伤（图S7D–S7F）。此外，研究人员还通过Snph小干扰RNA（siRNA）干扰海马神经元中的Snph表达，随后进行PKH67标记的MDVs处理（图S7G）。值得注意的是，Snph敲低显著降低了otMDVs在突触末梢的锚定（图5O和5P）。

这些发现共同证实了研究人员的假设：otMDVs在突触中的锚定依赖于表面标记物PAF与SNPH的结合（小编注：文章没有直接证据证明otMDV物理性地锚定在突触特定结构上，而是通过一系列的共定位成像和功能性干扰实验得出该结论。首先图5E-F证明otMDVs位于突触。其次，图5H证明otMDVs的PAF能结合SNPH，图5K-L利用抗体中和PAF导致otMDVs减少。第三，图5I-J证明otMDVs与SNPH在细胞空间上共定位，图5O-P敲减SNPH同样会导致otMDVs在突触的共定位减少）。

图5 | 表面标记物PAF与SNPH结合，介导otMDV突触占位，并导致能量亏缺。

图S7 | otMDVs通过SNPH介导的线粒体运输和mtDNA介导的KIF5抑制损害认知

10、含mtDNA的otMDVs通过促进cGAS-STING介导的KIF5抑制，损害海马体线粒体运输

线粒体运动能力对维持突触能量至关重要。KIF5作为轴突线粒体运输的主要顺行性运输蛋白，调控着突触部位的线粒体分布。研究人员使用MDVs处理海马原代神经元，并采用时间序列成像技术实时观察突触部位的线粒体运输动态。结果显示，otMDVs处理组中，突触线粒体密度显著降低；值得注意的是，即使是缺失PAF表面标志物的otMDVs^PAF⁻处理组，同样表现出类似的线粒体密度下降趋势（图6A和6B）。进一步分析发现，otMDVs^PAF⁻处理组局部线粒体的运输能力也受到显著抑制（图6C）。这些发现促使研究人员思考：除otMDVs表面标记物PAF外，是否存在其他机制参与海马突触处线粒体运输？

鉴于otMDVs^PAF⁻中富集了mtDNA，研究人员推测mtDNA参与了突触线粒体数量减少及ATP供应下降。如预期所示，otMDVs^PAF⁻和otMDVs的mtDNA水平均高于conMDVs（图6D）。因此，研究人员采用otMDVs^PAF⁻进行后续研究，以排除PAF标记物对otMDVs的影响。

大量研究表明，mtDNA能强效激活cGAS-STING信号通路。值得注意的是，与conMDVs处理相比，otMDVs^PAF⁻处理不仅可以激活cGAS-STING信号通路，还伴随受体HT22细胞中KIF5表达的抑制（图S7H和6E）。为确定mtDNA-cGAS-STING信号通路是否参与该过程，研究人员采用VBIT-4抑制otMDVs^PAF⁻释放的mtDNA（小编注：VBIT-4作用于线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）。VDAC1是线粒体与细胞质之间进行物质交换（如代谢物、离子）的主要通道。在细胞应激（如线粒体损伤、氧化应激）时，VDAC1会形成寡聚体。这个寡聚化的VDAC1复合物被认为是mtDNA从线粒体基质释放到细胞质的一个关键通道。文章这里VBIT-4通过特异性阻断VDAC1介导的mtDNA释放这一上游环节，来逆向验证mtDNA-cGAS-STING通路在其中的因果关系。）。经VBIT-4处理的MDVs既抑制了cGAS-STING激活，又逆转了KIF5抑制效应（图S7H和6E）。选择性STING抑制剂H151的处理同样可提升KIF5表达并伴随SNPH水平的升高，进一步证实cGAS-STING激活会降低KIF5表达（图S7I）。因此，研究人员深入探究了mtDNA对线粒体运输的影响。VBIT-4增强了线粒体与KIF5的共定位并逆转了ATP缺乏状态，表明阻断otMDVs^PAF⁻释放的mtDNA可促进突触线粒体运输（图6F–6I）。此外，VBIT-4处理改善了突触密度及树突棘缺失（图S7J–S7L）。这些发现揭示otMDVs^PAF⁻通过释放mtDNA并随后激活cGAS-STING通路，从而抑制突触功能。

鉴于应激可影响循环系统游离mtDNA水平及血脑屏障通透性，研究人员同时验证了循环系统游离mtDNA水平与血脑屏障通透性的同步升高的现象（图S7M和S7N）。为确定游离mtDNA能否穿透血脑屏障，研究人员采用体外与体内模型进行验证。在Transwell血脑屏障模型中，将mtDNA添加至上室，检测其在下室的存在情况。结果显示mtDNA可穿透血脑屏障进入下室，并且这种通透性在经EGTA干预后尤为显著（图S7O）。与此一致的是，在向受体对照小鼠或过度运动小鼠静脉注射荧光标记的mtDNA后，海马区均检测到荧光信号，且在过度运动条件下增强血脑屏障通透性时，该信号更为显著（图S7P）。上述发现表明，游离mtDNA可通过主动转运或屏障渗漏机制穿越血脑屏障。

为进一步验证循环系统游离mtDNA是否影响认知特征，研究人员使用DNase I从血浆中清除游离mtDNA。他们分别采集对照组小鼠及过度运动小鼠的血浆（含DNA去除与未去除两种处理），再输注至受体小鼠体内。过度运动小鼠的血浆损害神经元功能，但清除mtDNA的血浆未能缓解认知障碍，这表明循环系统游离mtDNA并非介导该认知表型的机制（图S7Q）。为探究mtDNA在otMDVs中的包装作用，研究人员通过机械裂解和超声处理使otMDVs发生渗透。将完整囊泡与渗透囊泡分别进行体内注射。与完整囊泡不同，渗透后的otMDVs未能诱发认知障碍，这表明了囊泡包装的关键作用（图S7R）。

为验证otMDVs^PAF⁻是否通过抑制KIF5而阻碍线粒体运输，研究人员用otMDVs^PAF⁻处理了过表达KIF5的海马神经元。结果显示KIF5过表达不仅逆转了线粒体运输功能损伤（图6J和6K），还改善了ATP水平及树突棘和突触功能缺陷（图6L、6M及S7S–S7U）。此外，研究人员将AAV-hSyn-Kif5或AAV-hSyn-Control注射至WT小鼠海马区，随后连续12周otMDVs给药。与对照组相比，Kif5过表达小鼠表现出增强的认知功能（图6N），同时海马区突触密度显著增加（图6O和6P）。

综上所述，突触功能障碍与认知损伤是通过双重机制由突触局部能量不足所介导的（图6Q）。首先，otMDVs表面的PAF标记物通过PAF-SNPH复合体占据突触锚定位点。其次，otMDVs释放的mtDNA经cGAS-STING通路下调KIF5表达，从而减少线粒体向突触的转运。

图6 | 含mtDNA的otMDVs通过促进cGAS-STING介导的KIF5抑制，损害海马体线粒体运输

11、otMDVs与人类过度剧烈运动诱发的认知功能障碍相关

基于otMDVs在小鼠过度运动诱发认知衰退中的调控作用，研究人员进一步探究了otMDVs对人类的潜在影响。研究人员招募了参与不同类型运动的受试者，包括羽毛球（n=15）、跑步（n=15）和举重（n=15）。在急性运动结束后立即采集血液样本，以评估血浆乳酸和otMDVs（以PAF⁺ MDVs表示）（图7A）。在所有运动模式中，循环系统乳酸水平与PAF⁺ MDVs均呈现显著正相关（图7B-7D）。

为进一步验证过度剧烈运动与人类认知结果之间的关联，研究人员开展了一项随机对照试验（RCT，randomized controlled trial）（图7E）。研究人员依据纳入与排除标准招募了40名参与者（过去3个月代谢当量约1000 MET-min/week）。参与者被分配至中等强度剧烈运动组或过度剧烈运动组。

研究人员发现两组运动后循环乳酸水平均升高，其中过度剧烈运动组增幅显著高于对照组（图7F）。值得注意的是，干预后过度剧烈运动组组的PAF⁺ MDVs水平及MDVs内mtDNA水平均显著升高，而对照组则保持不变（图7G和7H）。此外，PAF⁺ MDVs水平的变化与循环乳酸水平呈正相关（图7I）。

研究人员进一步采用质子磁共振波谱学技术（MRS）分析海马区N-乙酰天冬氨酸与肌酸比值（NAA/Cr）（小编注：N-乙酰天冬氨酸与肌酸的比值是评估神经元健康和能量代谢状态的一个关键性生物标志物）。结果显示过度剧烈运动组NAA/Cr比值降低，而对照组无此变化（图7J和7K）。此外，过度剧烈运动组参与者的流体智力评分和数字记忆能力均显著下降（图7L和7M）。关键在于，在调整皮质醇、BDNF和IL-6等混杂因素后，研究人员观察到PAF⁺ MDVs水平变化与流体智力及数字记忆变化均呈显著负相关，这确立了PAF⁺ MDVs作为过度运动诱发认知功能障碍的独立风险因素（图7N和7O）。

综上，这些结果表明，PAF⁺ MDVs可作为评估人类过度运动相关认知损伤风险的可靠指标。

图7 | otMDVs与人类过度剧烈运动诱导的认知障碍相关

 总结  

过度运动会损害认知功能，但其具体机制尚不明确。此研究揭示，过度剧烈运动引发的乳酸过度积累会刺激肌肉分泌线粒体衍生的囊泡（MDVs），进而诱发认知功能障碍。这些囊泡（命名为otMDVs）具有高线粒体DNA水平和表面标记物PAF的特征。它们倾向于迁移至海马神经元，替代内源性线粒体并引发突触能量危机。从机制上讲，otMDVs释放的mtDNA激活cGAS-STING依赖性抑制KIF5，从而阻断海马体线粒体向突触的运输。同时，otMDVs标志物PAF与SNPH协同作用，占据线粒体锚定位点，破坏突触能量供应。使用PAF中和抗体阻断otMDVs向海马区的迁移，可缓解过度剧烈运动诱发的突触丧失和认知功能障碍。值得注意的是，已有研究表明高水平循环otMDVs与认知功能障碍相关。综上，该研究揭示了一种独特的肌肉来源的MDVs亚群通过取代海马区线粒体并破坏其功能，从而导致认知功能下降。

原文连接：https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(25)00486-3