代谢学人

Science：“食欲刹车失灵”元凶

撰文 | 陈芳芳 胡敏  张俊 武霞 郭明伟

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张俊

背景介绍

肥胖患病率的上升已成为全球性的公共卫生问题。肥胖是由于能量摄入和能量消耗失调而形成的，而能量摄入和消耗主要由中枢神经系统（CNS，central nervous system）调节。最近的基因组和分子研究已经确定下丘脑是调节能量代谢的中枢。下丘脑不同核团整合循环和神经元信号来评估当前的能量状态，并与其他脑区协调以控制摄食行为和能量使用。尤其是黑皮质素系统（Melanocortin system）在摄食和能量平衡的中枢调节中起着至关重要的作用。该系统包括下丘脑弓状核（Arcuate nucleus of the hypothalamus，ARH，也称ARC）中表达抑制食欲的阿黑皮质素原（Pro-opiomelanocortin，POMC）神经元和表达刺激食欲的刺鼠相关蛋白（Agouti-related protein，AgRP）/神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）神经元，以及下丘脑室旁核（Paraventricular nucleus of the hypothalamus，PVH）和其他脑区中表达黑皮质素-4受体（Melanocortin-4 receptor，MC4R）的神经元。目前对能量稳态调节的大部分研究都是利用基因突变小鼠进行的。自从肥胖（ob）小鼠的发现和瘦素基因ob的定位克隆以来，研究人员对能量平衡的内分泌控制获得了更多的见解。尽管如此，针对能量稳态基因的研究仍然是有限的。

中枢神经系统内的大多数细胞类型都具有初级纤毛（primary cilia）——从细胞表面突出的触须样感觉器。多年来，越来越多的证据强调了下丘脑纤毛在调节哺乳动物能量代谢中的关键作用。在成年小鼠模型中，纤毛断裂会导致摄食过多而诱发肥胖，而纤毛功能的抑制性突变会导致以严重肥胖为特征的纤毛病（Ciliopathy）。对下丘脑中与能量稳态相关的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）进行详细的定位筛选，发现了7个纤毛GPCRs（小编注：研究人员鉴定和验证新型下丘脑纤毛定位的 GPCR 的方法如图所示：首先根据三个标准选择候选GPCR： (1）对从SSTR3、Smoothened和rhodopsin（这三个是已知的定位于纤毛的GPCR）信号中收集到的已知纤毛靶向序列 (CTS) 进行序列同源性搜索；（2）根据艾伦小鼠脑图谱（Allen Mouse Brain Atlas）提供的原位表达数据， 筛选在下丘脑区域显示出高表达水平的孤儿GPCR；（3）寻找有证据表明参与调节能量平衡的GPCR。 一个GPCR只要满足至少一个标准即可进入候选名单。接下来，研究人员构建了候选受体的C端GFP融合体，并通过免疫荧光显微镜检测了它们在视网膜色素上皮（RPE）细胞中的初级纤毛定位。RPE细胞是研究神经细胞纤毛的常用模型细胞系。从筛选出的42个候选GPCR中，有7个定位在RPE细胞中的纤毛上。分别是PGR15L、NPY家族受体2和5（NPY2R和NPY5R）、孤儿受体GPR83、galanin受体2和3（GAL2R和GAL3R）以及焦谷氨酰化 RFamide 肽受体 (QRFPR) ）

，包括神经肽Y受体Y2（NPY2R）和Y5（NPY5R）（小编注：NPY受体的配体是神经肽Y，即NPY，二者结合之后，使小鼠产生饥饿感，促进摄食；MC4R的配体是POMC神经元产生的α-MSH和Agrp神经元产生的Agrp，POMC神经元产生的α-MSH作用于MC4R，使小鼠产生饱腹感，抑制食欲，Agrp是MC4R的内源性拮抗剂，促进摄食）。这些NPY受体正确定位于纤毛对于维持小鼠的能量平衡至关重要。值得注意的是，MC4R还会在黑皮质素受体相关蛋白2（Melanocortin receptor-associated protein 2，MRAP2）的协助下定位到初级纤毛上，其纤毛定位的失调与小鼠和人类的肥胖都有关（小编注：在许多下丘脑神经元中，MC4R在伴侣蛋白MRAP2的作用下定位于初级纤毛上，在PVN神经元中，MC4R与纤毛标志蛋白ADCY3共定位，形成纤毛信号微区，是其调节能量平衡的关键功能位置。也有MC4R定位于胞膜上，参与短期或局部信号传导，但是无法代偿纤毛去信号的作用。无论MC4R定位在哪里，它本质上都是一个GPCR，可通过配体激活腺苷酸环化酶，产生cAMP激活PKA通路。定位于纤毛的MC4R能有效控制食欲，体重维持，实现长期的能量控制，而膜上的MC4R功能较弱。另外，如SSTR3、Smoothened和rhodopsin都是已知的定位于纤毛的神经元受体，包括NPY2R和NPY5R。当然也有非纤毛定位的受体，如非纤毛定位的MC1R很少富集到纤毛上，主要依赖膜区信号发挥功能。初级纤毛是一种在大多数哺乳动物细胞表面仅有一根、结构上呈“9+0”微管双联阵列（缺少中心对微管）、非运动性纤毛。它作为“感应天线”富集多种信号分子（GPCR、离子通道、受体酪氨酸激酶等），在细胞周期G0/G1期由母中心粒延伸形成，参与化学、机械和光信号的感知与转导。初级纤毛属于非运动性纤毛，机体中还存在运动性纤毛，结构上呈“9+2”微管双联阵列（中央2个微管），主要分布于呼吸道上皮细胞、精子等细胞上。一些代谢器官上也存在纤毛，例如胰岛β细胞上的初级纤毛，在葡萄糖刺激下可发生钙离子波动，并通过自分泌/旁分泌调节胰岛素分泌，纤毛功能缺失会损害葡萄糖稳态；脂肪祖细胞也具有初级纤毛，通过Wnt等信号通路调控细胞命运。）。作为一种GPCR，MC4R可与激动型鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α亚基（Gαs）偶联，激活腺苷酸环化酶（Adenylyl cyclase，ADCY），释放环磷酸腺苷（cAMP）。ADCY3也定位于整个大脑的初级纤毛，并与小鼠和人类的肥胖有关。然而，Gαs是否以及如何同时在细胞质或初级纤毛中发挥调节cAMP生成与中心性肥胖表型相关的功能，目前仍不清楚。

在这里，研究人员进行了大规模的正向遗传学筛选（小编注：正向遗传学筛选，研究者首先不预设是哪个特定基因在起作用，而是通过制造大量随机突变，在群体中产生各种各样的表型变异，然后从中筛选出符合特定标准的、感兴趣的异常表型，最后再去定位和鉴定造成这个表型的突变基因），并鉴定了一个孤儿GPCR，G蛋白偶联受体45（GPR45），作为PVH/MC4R神经元中黑皮质素系统的关键调节因子。研究人员还发现了GPR45在将Gαs转运到初级纤毛以维持纤毛cAMP池中的非经典作用。

敲黑板啦！

1. 正向遗传学筛查发现2个肥胖等位基因是由Gpr45错义突变引起的；

2. Gpr45^-/-小鼠的肥胖表型是由多食引起的；

3. GPR45在下丘脑室旁核中表达并特异性定位于初级纤毛；

4. GPR45将Gα_s转位到初级纤毛中，通过协调MC4R和ADCY3信号来调节纤毛中的cAMP水平；

研究结果

1. 正向遗传学筛查发现2个肥胖等位基因是由Gpr45错义突变引起的

为了揭示肥胖的潜在机制，研究人员使用正向遗传筛选平台，结合自动减数分裂图谱（小编注：自动减数分裂图谱（Automated Meiotic Mapping）是一种利用高通量基因分型技术，结合减数分裂过程中的遗传重组规律，快速定位导致特定表型的致病突变或基因的方法。其核心是通过分析后代群体中表型与基因型的连锁关系，确定突变在染色体上的位置）来鉴定影响小鼠体重的基因突变。经N-乙基-N-亚硝基脲（ENU，小编注：ENU可以诱导小鼠的表型变异，这种物质会在种系 DNA 中产生单碱基对置换）诱变的第1代（G1）小鼠经过2代繁殖，产生了平均每个家系40只的第3代（G3）种系突变小鼠的血统，每只小鼠携带了从同一血统遗传的大约45个突变基因（小编注：这些经过ENU诱变的G1小鼠被繁殖了两代，产生了包含多个家系的后代，每个家系代表着特定的遗传背景和突变组合，可能包含了多个突变。每个家系G3代小鼠的数量是不固定的，但平均每个家系中有40只G3代小鼠）。对总共160968只含有253464个编码或剪接突变的G3小鼠，在其一生中至少称重一次（小编注：查阅本篇文章所引用的文章（T. Wang et al.PNAS,2015），繁殖和筛选示意图如下，根据本篇文章所述，再结合所引用的文章，本篇文章利用的是方案B进行繁殖，将诱变的G0雄性与WT雌配交配，再将G1雄性与B6雌性杂交以产生G2小鼠。G3小鼠是G2雌性与其G1父亲回交的结果。

文章中并没有说ENU诱导会导致G0代产生多少个突变，并且ENU的用量不同也会导致G0代产生不同数量的突变，遗传给后代，所以推测45个突变是基于实验观察和统计平均值得来的，不涉及精确的数学公式。根据原文的意思，推测可能是通过ENU诱变大量的G0，让大量的G1与G2的小鼠进行回交，从而产生了大量的G3小鼠。根据本篇文章所引用的文献，预测ENU诱导的突变对转录本剪接的影响是基于Yeo和Burge开发的最大熵模型。得分越高的序列被用于剪接的可能性越大。评估了所有ENU诱导的突变对天然序列得分的影响，推测本篇文章也是预测而得的突变数量）。估计常染色体饱和度为 60.29%--常染色体基因中蛋白质产物受损或被破坏的部分，在纯合状态下研究其表型效应两次以上（小编注：指的是通过ENU诱变产生的小鼠群体中，有多少比例的常染色体（非性染色体）基因，特别是那些编码蛋白质的基因，已经在基因组中产生了突变，并且这些突变在纯合子状态下至少被研究过两次或更多次，以观察突变对表型的影响）。

在这些突变中，在家系R5319中发现了一种被称为扩张性（expansive）的表型，其特征是在正常饮食的情况下体重增加（图1A）（小编注：REF，参考等位基因为纯合子;HET，等位基因和变异等位基因的杂合子;VAR，变异等位基因的纯合子，这张图展示的标准化体重，按照年龄和性别进行缩放。根据所引用的PNAS文章，标准化体重的计算方法包括回归性分析、Z-score标准化（μ代表同一年龄和性别中的平均体重，σ代表该组的标准差）、同时考虑不同的G2母亲可能由于母体效应突变而影响其后代的表型，因此，在统计分析中，也会选择将G2母亲身份视为潜在的混杂因素以控制这种影响。标准化体重消除因年龄、性别甚至母体效应导致的差异，可以将不同小鼠的体重进行公平比较）。expansive表型被表征为一个数量性状（小编注：是指那些在群体中呈现连续分布的性状，其表型通常由多个基因共同作用，并且受到环境因素的影响。与单基因控制的孟德尔性状不同，数量性状的表型变化是连续的，而不是离散的），18只G3小鼠的体重按年龄和和性别进行分级（表S1）。自动减数分裂图谱分析表明，Gpr45的一个错义等位基因是致病突变，在G1存在的所有63个突变中（图1B和表S2），它表现出最强的隐性遗传连锁性（P=6.777×10⁻¹⁶）（小编注：指实验起始的那一代小鼠（通常是经过诱变处理的），所有后代都源自它。说明在最初的这只小鼠身上检测到了63个突变，但只有Gpr45的这个突变与肥胖表型的连锁性最强）。expansive突变是由T到C的单核苷酸转换，导致GPR45蛋白第214位的丝氨酸替换为脯氨酸（S214P）。随后，在家系R5667中鉴定到第二个Gpr45等位基因，命名为广泛性突变（extensive）（图1C）。利用53只G3小鼠的体重比例数据（表S3），将同样以体重增加为特征的extensive表型表征为一个数量性状。与expansive表型相似，在G1代小鼠中鉴定的52个突变中（图1D和表S4），extensive表型表现出隐性遗传模式（P=2.602×10^-7）。这种突变是从A到G的单核苷酸突变，导致GPR45蛋白第287位的酪氨酸被半胱氨酸取代（Y287C）。

通过CRISPR-Cas9基因靶向，产生了Gpr45的无效等位基因。雄性和雌性小鼠的Gpr45敲除（Gpr45^-/-）小鼠从6周龄开始体重增加，12周龄时完全表现出肥胖表型（图1E-I以及图S1A-D）。解剖发现，与野生型（WT，+/+）同窝小鼠相比，12周龄Gpr45^-/-小鼠的脂肪组织体积增大，包括附睾白色脂肪组织（eWAT）、腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）（图1J）。H&E染色结果表明脂肪细胞肥大（图1K）。在12周龄时，Gpr45^-/-小鼠的空腹血糖水平升高，而空腹胰岛素水平和WT小鼠相当（图1L、M，图S1E-F）。在12周龄的Gpr45^-/-小鼠中观察到葡萄糖不耐受（图1N和图S1G）和胰岛素抵抗（图10和图S1H）。Gpr45^-/-小鼠血液胆固醇升高，而甘油三酯无变化（图1P、Q，图S1I、J）。此外，12周龄的Gpr45^-/-小鼠肝脏大而苍白（图1J），肝脏重量（图1R和图S1K）和肝脏甘油三酯增加（图1S和图S1L）。H&E染色（图1T）和油红O染色结果显示肝脏中储存了大量的脂质（图1U）。这些数据证实，在expansive和extensive品系中，Gpr45突变是观察到的肥胖表型的原因。

图1 | expansive和extensive肥胖等位基因的鉴定及致病基因Gpr45的定位

图S1 | 雌性Gpr45^-/-小鼠的表型

2. Gpr45^-/-小鼠的肥胖表型是由多食引起的

研究人员在Gpr45^-/-小鼠的肥胖表型刚开始出现时，对5周龄Gpr45^-/-小鼠和同窝WT小鼠进行了代谢笼实验，以测量能量的输入和输出（图2A-C）。与同窝WT小鼠相比，Gpr45^-/-小鼠的摄食量显著增加（图2D、E）。与摄食增加表型一致的是，Gpr45^-/-小鼠表现出呼吸交换率（respiratory exchange rate，RER）升高，表明即使在光照周期内，Gpr45^-/-小鼠仍然偏好碳水化合物作为燃料来源（图2F）。间接热量计分析发现，Gpr45^-/-和WT小鼠的产热和体力活动没有差异（图2G-J）。正常的饲养温度（23℃）低于小鼠的热中性区（30℃），这可能会限制使用小鼠模型来研究人类肥胖。因此，Gpr45^-/-和WT小鼠从4周龄开始分别在23℃或30℃下饲养8周，以监测肥胖表型的发展。与室温饲养的Gpr45^-/-小鼠相比，热中性饲养的Gpr45^-/-小鼠的肥胖程度并没有减轻，反而进一步加重（图S2A-D）。与之前的报道不同的是，Gpr45^-/-小鼠在整个实验过程中，在没有食物的情况下，在急性冷应激期间很好地维持了核心体温（图2K），下丘脑中的POMC mRNA和蛋白正常表达（图S2E-G）。因此，GPR45的缺失主要会导致摄食量增加和肥胖的发生。

为了进一步确认多食表型，将Gpr45^-/-小鼠和同窝WT小鼠单独饲养，从5周龄开始，每天监测食物消耗量和体重。Gpr45^-/-小鼠的日摄食量呈波动性，但从40日龄开始持续增加，而且从37日龄开始，Gpr45^-/-小鼠的累积摄食量显著增加，此时Gpr45^-/-小鼠的体重与同窝WT小鼠相似（图2L-N）。在过量摄食发生后，体重在42日龄时开始增加（图2N）。为了检测是否是过度摄食导致肥胖表型，从5周龄开始，给Gpr45^-/-小鼠配对喂食与同窝WT小鼠相同数量的食物。配对喂养3周后，Gpr45^-/-小鼠和对照组小鼠的体重没有差异（图2O）。与自由进食的小鼠相比，配对喂养可挽救Gpr45^-/-小鼠的肥胖表型以及糖尿病和脂肪肝表型（图2P-R、图S2H）。因此，摄食过多直接导致GPR45缺失小鼠肥胖的发生。

图2 | Gpr45^-/-小鼠的肥胖表型是由摄食量增加引起的

图S2 | Gpr45^-/-小鼠是摄食过度，没有产热缺陷

3. GPR45在下丘脑室旁核中表达并发挥调节体重的功能

通过qPCR检测到Gpr45 mRNA在脑中高表达，在其他主要的小鼠组织中几乎检测不到（图3A）。研究人员使用了几种市售的抗GPR45抗体，均没有检测到脑内内源性GPR45蛋白的水平。为了更好地检测GPR45蛋白的表达模式，研究人员利用CRISPR-Cas9技术在GPR45的C端敲入绿色荧光蛋白（GFP，green fluorescent protein）标签（Gpr45-GFP）（图3B）。在所需位点插入正确GFP序列的G1代经过两代培育达到纯合。在GPR45蛋白的C末端插入GFP标签并没有破坏其功能，因为在纯合的Gpr45-GFP小鼠中没有出现肥胖表型（图S3A-C）。此外，使用针对Gfp mRNA的引物组进行的qPCR分析显示，小鼠各组织中Gpr45 mRNA的表达模式与Gfp mRNA的表达模式一致，进一步验证了Gpr45-GFP敲入小鼠模型（图S3D）。与WT对照小鼠相比，3个独立的Gpr45-GFP品系在全脑裂解液中显示出非常特异的GPR45蛋白表达（图3C）。进一步将表达Gpr45-GFP小鼠的大脑进行分区。GPR45蛋白在下丘脑中表达最高，在脑干、皮层、嗅球、海马和小脑中表达较低（图3D），Gpr45 mRNA和Gfp mRNA的表达模式相似（图S3E）。与Gpr45 mRNA表达谱一致，在脑外没有检测到GPR45蛋白（图S3F）。由于下丘脑中GPR45蛋白的高表达以及该区域在调节能量代谢中的重要性，研究人员将研究重点放在了该区域。在下丘脑内，原位杂交实验（RNAscope）在PVH中检测到Gpr45 mRNA（图3E），而在ARH的Pomc表达神经元中没有发现Gpr45 mRNA的明显富集（图3F）。

为了研究GPR45在下丘脑特定区域和神经元中功能缺失的情况，研究人员按照之前的描述，使用CRISPR-Cas9技术构建了Gpr45-flox小鼠（图3G）。将Gpr45-flox小鼠与针对不同下丘脑神经元或区域的Cre品系杂交（图3H），Pomc-Cre用于敲除ARH中表达Pomc神经元中的Gpr45，Agrp-Cre用于敲除ARH中表达Agrp神经元中的Gpr45，Sim1-Cre用于敲除PVH中的Gpr45（小编注：Sim1（Single-minded homolog 1）是PVH的发育转录因子，Sim1-Cre广泛表达于PVH大多数神经元中，因此，使用Sim1-Cre::Gpr45-flox小鼠可实现在整个PVH神经元群中泛敲除Gpr45，包括表达CRH、TRH、OT、AVP、MC4R等的多种功能性神经元亚型。总结，Sim1-Cre在PVH是个“泛敲”，而不是特定神经元类型的敲除），Mc4r-Cre用于敲除PVH中表达Mc4r的神经元中的Gpr45（小编注：Gpr45在PVH中特异性表达（图3E）。补充图S7-S10更证明其他区域表达极低甚至检测不到。这种空间特异性是研究设计的根本依据。其次，下丘脑的其他核团：VMH（腹内侧核）传统认为调控饱腹感和能量消耗，但近年研究更强调其性行为调控作用；DMH（背内侧核）主要参与昼夜节律和应激反应；LHA（外侧下丘脑）主要的orexin神经元，调控觉醒、动机和摄食；SCN是生物钟核心，与代谢间接相关；SON主要调控水盐平衡，与肥胖机制较远。论文图S7-S8特意检测了这些核团的GPR45表达，结果均为阴性，说明作者已经系统排查过主要核团。ARH和PVH是下丘脑调控能量代谢和摄食行为的两个核心节点，ARH（Arcuate nucleus）含有POMC和AgRP两类功能拮抗的代谢调控神经元，负责感知外界代谢状态（例如瘦素、胰岛素等）。PVH（Paraventricular nucleus）是下丘脑-脑干通路的枢纽，整合ARH信号并调控自主神经和内分泌输出。这里ARH仅作为对照，ARH是瘦素信号输入枢纽，但GPR45在此区域不表达（图3F），敲除后无表型，排除其必要性。ARH中研究POMC和AgRP神经元，因为它们是最典型、互为拮抗的一对能量代谢调控细胞类型，调节食欲和能量消耗。PVH中研究Sim1神经元（泛敲）和MC4R阳性神经元（特异敲），因为Sim1涵盖PVH主干神经元群；MC4R是下丘脑-脑干摄食抑制通路的关键节点，是POMC通路的下游靶点。研究这些“经典”亚型具有代表性，能明确验证Gpr45是否通过这些关键神经元发挥作用。NPY和AgRP常常共表达于同一神经元中，因此使用Agrp-Cre小鼠，已经实现了在NPY/AgRP共表达神经元中的敲除，无需再单独设计NPY-Cre进行实验）。即使是在16周龄，Gpr45^flox/flox;Pomc-Cre小鼠的脂肪重量和体重与对照小鼠相似（图S4A-C）。同样，通过Agrp-Cre敲除Gpr45并没有改变16周龄小鼠的体重和脂肪重量（图S4D-F）。相比之下，Gpr45^flox/flox; Sim1-Cre和Gpr45^flox/flox; Mc4r-Cre小鼠在16周龄时体重、脂肪重量和瘦肉重量都显著增加（图S4G-L）。鉴于Pomc-Cre和Agrp-Cre小鼠没有出现肥胖表型，研究人员使用高脂饮食（HFD）来尝试加速肥胖表型的发生。所有Gpr45^flox/flox; Cre和Gpr45^flox/flox对照小鼠从6周龄开始喂食HFD，并维持4周。即使在HFD条件下，Gpr45^flox/flox; Pomc-Cre和Gpr45^flox/flox; Agrp-Cre小鼠也没有出现肥胖表型（图3I-N）。然而，Gpr45^flox/flox; Sim1-CRE和Gpr45^flox/flox; Mc4r-Cre小鼠的体重和脂肪重量显著增加（图3O-T）。

虽然Sim1-Cre和Mc4r-Cre都表示PVH的神经元，但它们在其他脑区也有表达。为了实现PVH特异性敲除Gpr45，并避免下丘脑发育过程中Cre驱动的其他区域敲除的混杂效应，研究人员将腺相关病毒（AAV）-Cre立体定向注射到Gpr45^flox/flox小鼠的PVH中（图3U）。由神经元特异性人突触蛋白1（hSyn，human synapsin 1）启动子驱动的 Cre表达确保了神经元中Gpr45的完全缺失。利用GFP共表达用于识别Cre表达细胞（图S5A-B），Gpr45 mRNA水平的降低证实了Gpr45在PVH中的成功缺失（图S5C）。AAV注射2周后，与注射AAV-hSyn-GFP的对照组小鼠相比，注射AAV-hSyn-GFP-Cre的Gpr45^flox/flox小鼠体重显著增加（图3V）。注射7周后，AAV-hSyn-GFP-Cre组小鼠体重、脂肪重量和瘦体重均显著增加（图3W-Y）。然而，在WT小鼠的PVH中注射相同的AAV-hSyn-GFP-Cre并没有导致肥胖或明显的毒性，进一步证实了肥胖表型是由于Cre介导的Gpr45缺失所致（图S5D-I）。因此，PVH神经元中的GPR45对体重的调节起着直接的作用。

图3 | GPR45在PVH神经元中高表达，调节能量稳态

图S3 | Gpr45-GFP敲入小鼠的表征

图S4 | 用Sim1-Cre或Mc4r-Cre敲除Gpr45导致在正常饮食条件下肥胖的发生

图S5 | AAV立体定位注射的验证

4. GPR45特异性定位于初级纤毛

为了进一步了解GPR45在细胞内的作用，研究人员检测了它的亚细胞定位。正如红色的乙酰化α-微管蛋白（AcTub）信号所标记的那样，GPR45只定位于下丘脑N11（小编注：是实验室人工构建的永生化细胞系。它来源于小鼠下丘脑组织）细胞的初级纤毛上（图4A）。这种纤毛定位并不是N11细胞所特有的，因为在IMCD3细胞的初级纤毛中也检测到了GPR45，IMCD3细胞是一种来源于肾脏的内髓质集合管细胞系（图4B）（小编注：初级纤毛是非运动性纤毛，绝大多数哺乳动物细胞（包括神经元和上皮细胞）仅含单根初级纤毛，作为"细胞天线"感知胞外信号（如激素、机械刺激）。图4A-B中每个细胞仅显示一根红色Ac-Tub标记的纤毛。纤毛"看似在细胞核内"主要是因为成像技术局限，共聚焦显微镜的Z轴切片可能使靠近核膜的纤毛基部（basal body）与核区域重叠，初级纤毛从基体（中心粒衍生）伸出，而基体常位于核旁。Ac-Tub是纤毛特异性标记，但有局限性。乙酰化α-微管蛋白（Ac-Tub）是纤毛轴丝（axoneme）的主要组分，因微管蛋白在纤毛内稳定存在而被乙酰化修饰。虽然Ac-Tub也存在于其他稳定微管结构（如神经元轴突），但结合纤毛形态（短棒状突出物）和定位（细胞顶端），在图4中可作为纤毛标记。论文后续使用ADCY3（图4I）和ARL13B（纤毛膜蛋白，图6E-F）作为更特异的纤毛标记）。纤毛定位的GPCRs需要管状家族蛋白TUB双转录因子（TUB）和TUB样蛋白3（TULP3）。TUB和TULP3在纤毛运输中作为高度保守的鞭毛内复合物-A（Intraflagellar complex-A，IFT-A）复合体的适配因子发挥作用。

扩展阅读：纤毛蛋白运输的调控机制

纤毛定位的G蛋白偶联受体（GPCRs）的运输高度依赖于管状家族蛋白TUBBY（TUB）和TUBBY样蛋白3（TULP3），它们作为保守的适配因子与鞭毛内运输复合物A（IFT-A）协同工作。

TULP3和TUB通过其C端结构域直接结合IFT-A复合物（含6个亚基），同时通过N端磷酸肌醇结合域识别细胞膜上的PtdIns(4,5)P₂脂质。TULP3/IFT-A识别GPCR的纤毛靶向信号（CTS），将GPCR货物（如SSTR3、GPR161、MCHR1）装载到运输复合体上。

当复合体进入纤毛后，纤毛膜特有的5-磷酸酶INPP5E将PtdIns(4,5)P₂水解为PtdIns(4)P。TULP3失去对PtdIns(4)P的亲和力，触发GPCR从IFT-A复合体上卸载，使其滞留于纤毛腔。

IFT-A介导的GPCR进入纤毛不依赖驱动蛋白-2的机械动力，而是由小GTP酶RABL2-GTP在过渡纤维处结合IFT-B，推动IFT-A/GPCR复合体穿越扩散屏障。

上游调控：纤毛内ARL13B（小GTP酶）激活ARL3-GTP，促进脂化蛋白INPP5E释放，维持纤毛PtdIns(4)P水平。

下游效应：INPP5E生成的PtdIns(4)P是TULP3卸载GPCR的关键条件，形成"INPP5E→PtdIns(4)P→TULP3卸载"的正反馈环。

TUB/TULP3-IFT-A系统确保GPCRs精准定位至纤毛，使纤毛成为独立的信号处理单元。磷酸肌醇开关使纤毛能根据信号需求实时调整GPCR库存。该通路的破坏直接导致纤毛病，例如敲除IFT-A（如Ttc21b突变）或TULP3会导致GPCR（如多囊肾蛋白PC1/PC2、肥胖相关受体MC4R）无法进入纤毛，直接导致纤毛病表型（如肥胖、多囊肾），另外IFT-A突变与骨骼发育异常密切相关。

参考文献：

[1] Nachury MV, Mick DU. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Jul;20(7):389-405.

事实上，当GPR45与TULP3在293T细胞中共表达时，二者发生了相互作用（图4C）。在Tulp3敲除（Tulp3^-/-）的IMCD3细胞中，GPR45的纤毛定位被完全破坏（图S6A）。由于Tulp3的完全敲除会减少纤毛长度，并可能破坏纤毛结构，因此研究人员使用Tulp3特异性小干扰RNA（siRNA）在N11细胞中敲低Tulp3的表达，以评估其对GPR45定位的影响（图4D）。Tulp3敲低不改变纤毛长度，但显著减少了GPR45的纤毛定位（图4E-H）。然后，研究人员研究GPR45中介导TULP3结合及其纤毛运输的纤毛定位序列（Ciliary localization sequence，CLS）（小编注：CTS是存在于部分纤毛膜蛋白中的短肽基序，作为分子标签被特定运输机器识别，指导蛋白定向转运至纤毛膜。CLS与转运蛋白（如Transportin-1/TNPO1、TULP3）或脂质修饰酶结合，形成复合物（如TNPO1-Rab8-CTS），介导纤毛靶向。纤毛蛋白的定位机制高度多样化，CTS仅是其中一种途径。其他机制包括：被动扩散、跨膜域依赖、脂质修饰依赖、晚期内体分选、IFT依赖的主动运输、循环内吞途径、非高尔基体途径等。因此并非所有具有纤毛定位的蛋白都存在CLS。此外，依赖CTS定位方式的纤毛蛋白主要分为信号受体（GPCRs）、离子通道（PKD2/CNGB1）和酶（INPP5E），这些蛋白具有的CTS没有共有序列，并且长度从4aa（VAPA）到15aa（FDRELYL）不等。原因可能在于不同的转运复合物识别不同结构特征）。先前的研究表明，GPCRs的胞内环3（Intracellular loop 3，IC3）和两亲性螺旋的带电残基常含有CLS。通过对GPR45的IC3的α螺旋进行疏水矩分析，研究人员确定了2个预测的两亲性螺旋（图S6B）。靶向删除这些螺旋中的带电残基发现，删除一个螺旋部分降低纤毛定位，而删除两个螺旋完全破坏了GPR45的纤毛定位（图S6C-G）。因此，TULP3通过识别GPR45的IC3中的CLS，在将GPR45转运到初级纤毛中起着至关重要的作用。

研究人员使用Gpr45-GFP敲入小鼠研究了内源性GPR45在下丘脑和各个脑区的亚细胞定位。在PVH中，GPR45仅定位于初级纤毛，因为它与红色ADCY3信号共定位（小编注：ADCY3是纤毛特异性腺苷酸环化酶，在多种神经元（包括下丘脑PVH神经元）的初级纤毛中富集。ADCY3并非纤毛的结构蛋白，而是纤毛信号传导的关键效应分子。它定位于纤毛膜上，形成局部cAMP信号中心并激活下游信号）（图4I、图S7B）。只有在Gpr45-GFP小鼠才能检测到GFP信号，而在WT对照小鼠中不存在（图4J、图S8B）。值得注意的是，GPR45信号在其他主要下丘脑核团的初级纤毛中较弱或检测不到，包括ARH、下丘脑前核（AHN）、视交叉上核（SCH）、下丘脑背内侧核（DMH）、腹内侧下丘脑核（VMH）、下丘脑外侧区（LHA）和结节核（TU）（图S7、S8）。同样，GPR45-GFP信号在大脑皮层（CTX）、海马、中脑（MB）、小脑（CB）、延髓（MY）和脑桥（P）等其他脑区的初级纤毛中检测不到或极少（图S9、S10）。这些发现与Gpr45 mRNA在PVH中的高表达是一致的（图3E），也与Gpr45^flox/flox;Sim1-Cre小鼠（图3O-Q，图4G-I）和通过AAV-Cre特异性敲除Gpr45的PVH小鼠的肥胖表型一致（图3U-Y）。GPR45在PVH中的选择性纤毛定位提示其在PVH神经元中发挥调节食欲的功能。

图4 | GPR45只定位于初级纤毛

图S6 | GPR45的IC3中的纤毛定位序列对于TULP3介导的纤毛靶向至关重要

图S7 | Gpr45-GFP基因敲入小鼠下丘脑不同核团GFP表达特征

图S8 | WT小鼠下丘脑不同核团GFP表达的鉴定

图S9 | Gpr45-GFP基因敲入小鼠其他脑区GFP表达的鉴定

图S10 | WT小鼠其他脑区GFP表达的鉴定

5. GPR45将Gα_s转位到初级纤毛中

在未受刺激的细胞中，GPCR与细胞膜上的各种Gα亚基相互作用，包括Gα_s、Gα_i、Gα_q和Gα₁₂家族（小编注：Gα亚基是异源三聚体G蛋白（由Gα、Gβ、Gγ组成）的核心功能单元，作为GPCR信号转导的分子开关，通过结合GTP或GDP切换活性状态，调控下游效应分子。其亚型在不同细胞中激活特异通路，实现生理功能的精准调控。1、Gαₛ（激活型）作用机制：激活腺苷酸环化酶（AC）→↑cAMP → 激活PKA/CREB。功能上，在脂肪细胞中促进脂解；在本文下丘脑PVH神经元中激活纤毛内ADCY3，进一步抑制食欲。2、Gαᵢ（抑制型）作用机制：抑制AC → ↓cAMP → 抑制PKA。功能上，在GABA能神经元中抑制神经递质释放，在免疫细胞中抑制细胞因子的分泌来抑制炎症。3、Gαq作用机制：激活PLCβ → 水解PIP₂生成IP₃（↑胞内Ca²⁺）和DAG（激活PKC）。功能上，在胰岛β细胞中通过GLP-1受体促进胰岛素分泌等。4、Gα₁₂作用机制：激活RhoGEF → ↑RhoA → 重构细胞骨架（肌动蛋白聚合）或激活NF-κB。功能上，在肿瘤细胞中通过RhoA驱动伪足形成，进而促进转移）。在检测的主要Gα亚基中，GPR45与Gα_s的相互作用最强（图S11）。在IMCD3细胞中，过表达血凝素（HA）标记的Gα_s（HA-Gα_s）散在分布在细胞质中（小编注：一般情况下，Gα亚基通过N端脂质修饰（如豆蔻酰化、棕榈酰化）插入质膜。但是Gαₛ没有脂质修饰基序，因而其膜定位高度依赖与Gβγ亚基的结合（Gβγ通过γ亚基的法尼基化锚定在膜上）。未激活时，Gαβγ三聚体通过Gβγ的脂质修饰锚定在质膜内侧。GPCR激活时，GPCR催化Gα释放GDP并结合GTP，于是Gα-GTP与Gβγ解离。解离后的Gα-GTP因失去Gβγ的膜锚定作用，而短暂扩散至胞质，进而激活胞质中的效应分子。然而，这里的IMCD3细胞中过表达HA-Gαₛ，没有共表达Gβγ，反映其缺乏稳定膜锚定，进一步会被GPR45一起带入纤毛，如果锚定在细胞膜上，则可能转运失败。总之，这一现象是合理的），在初级纤毛中没有定位（图S12A、B）。共表达3xFlag标记的Gpr45（Gpr45-3xFlag）导致几乎所有的HA-Gα_s转位到初级纤毛上，表现为Gpr45-3xFlag与HA-Gα_s的共定位（图S12C）以及HA-Gα_s与纤毛标记Ac-Tub的共定位（图S12D）。鉴于TULP3在GPR45纤毛定位中的作用，研究人员在Tulp3^-/- IMCD3细胞中评估了GPR45对Gα_s的易位。Gα_s和GPR45部分共定位于细胞质中（小编注：新合成的GPCR在内质网（ER）和高尔基体中经历折叠、修饰和转运。若受体未正确折叠或缺乏必要的辅助蛋白（如TULP3），可能滞留在ER/高尔基体中，无法到达细胞膜。实验中观察到的细胞质定位可能是未完全转运的GPR45。在图S12E-F中，TULP3是IFT-A复合体的适配蛋白，负责将特定GPCR（如GPR45）转运至初级纤毛。在Tulp3-/-细胞中，GPR45因缺乏转运载体而无法定位到纤毛，可能积累在细胞质中。），但在没有TULP3的情况下，两者均不定位于纤毛（图S12E、F）。在N11细胞中也观察到Gα_s向初级纤毛的类似转位（图5A-C）。为了检测内源性Gα_s的转位，研究人员使用了特异性识别Gα_s蛋白的抗体（图S13）。在N11细胞中，只有少部分纤毛中含有低水平的Gα_s，大多数纤毛中没有检测到Gα_s的信号（图5D）。然而过表达GPR45会导致内源性Gα_s在所有纤毛中积累 (图 5，E、H 和 I）。接下来，研究人员试图确定GPR45的哪个区域对Gα_s的纤毛转位至关重要。研究人员利用Alpha Fold 3建立了GPR45与Gα_s之间相互作用的模型（图S14）。虽然GPR45的C末端尾巴（C-tail）显示出较低的预测局部距离差异测试（pLDDT）得分，但其出现在非常接近Gα_s的位置（图S14）。这是非典型性的，因为在大多数GPCRs中，Gα_s偶联主要依赖于跨膜结构域（TM3和TM5），部分来自胞内环（IC2和IC3）的贡献。为了评估GPR45 C端尾在Gαs易位中的作用，我们与GPR161进行了结构域交换实验，GPR161是一种特征明确的Gαs偶联纤毛GPCR。单独过表达GPR161并不能诱导Gα_s向纤毛转位（图5F、H、I）。此外，用GPR45的C尾（GPR45-161）替换GPR161的C尾，尽管GPR45-161仍然定位于纤毛，但未能将Gα_s转位到纤毛中（图5G-I）。因此，GPR45的C尾在介导Gα_s的纤毛转位过程中起着至关重要的作用。

为了进一步探究GPR45对Gα_s转位的相关性，研究人员检测了Gpr45-GFP基因敲入小鼠PVH中Gα_s的分布情况。Gα_s与GPR45共定位于PVH神经元的纤毛（图5J）。在WT小鼠的PVH中，47.8%（±5.0%）的ADCY3⁺纤毛可以观察到Gα_s⁺纤毛（图5K、M）。相反，在Gpr45^-/-小鼠的PVH中，Gα_s⁺纤毛仅占ADCY3⁺纤毛的14.6%（±8.7%）（图5L、M）。因此，Gα_s在PVH中的纤毛定位依赖于GPR45的作用。

图5 | GPR45靶向Gαs进入初级纤毛

图S11 | GPR45与Ga亚基的相互作用图谱

图S12 | 在IMCD3细胞中，GPR45靶向Gas进入纤毛

图S13 | siRNA介导的Gnas敲低和Gαs抗体的验证

图S14 | 通过AlphaFold 3预测GPR45-Gαs的结构

6. GPR45通过纤毛Gα_s靶向调节纤毛中的cAMP水平来协调MC4R和ADCY3信号

Gα_s偶联的GPCRs的激活导致Gα_s的释放，随后激活ADCYs产生cAMP。在不同的ADCY中，ADCY3在神经元初级纤毛中的作用与人类的单基因肥胖病因有关（小编注：单基因肥胖，即指由单一基因突变或缺陷引起的肥胖，有研究中发现，ADCY3基因的功能缺失突变与早发性重度肥胖相关。在小鼠模型中，Adcy3敲除或突变（如L278H）会导致肥胖表型（如文中Adcy3L278H/L278H小鼠），进一步验证了ADCY3在能量稳态中的核心作用。）。在N11细胞中，GPR45和ADCY3共定位于初级纤毛上（图6A）。由于GPR45招募Gα_s进入纤毛，研究人员检测了过表达GPR45的细胞中cAMP水平。GPR45过表达并没有增加cAMP水平，反而导致细胞内cAMP总量下降（图6B）。然而，这种降低依赖于Gα_s，因为GPR45在敲低Gα_s的情况下并没有降低细胞内cAMP的水平（图6C）。这表明GPR45可能不是一个经典的GPCR。相反，它与Gα_s结合，促进其转位到纤毛中。GPR45的过表达可能会螯合Gα_s，阻止其与ADCY3的相互作用和随后的激活。支持这一假设的是，过表达GPR45显著降低了Gα_s与ADCY3之间的相互作用（图6D）。为了探究转位的Gα_s是否可以激活纤毛中的ADCY3，研究人员使用了一种与Gα_s-Gβγ界面结合并融合了GFP（NB35-GFP）的纳米抗体（NB35）来监测活性Gαs-Gβγ异三聚体的形成。在N11细胞中，NB35-GFP主要存在于细胞质中（图6E）。然而，过表达GPR45导致NB35-GFP在纤毛中积累，而在细胞质中几乎没有信号（图6F-H）。由于初级纤毛被描述为一个信号枢纽，集中了包括cAMP在内的各种分子，因此GPR45对Gα_s的易位表明，纤毛和细胞质中的cAMP水平可能受到不同的调节。为了验证这个假设，研究人员使用了一个基于荧光共振能量转移（FRET，Förster resonance energy transfer）的cAMP传感器（Arl13b-H187）来测量纤毛中的cAMP水平。事实上，GPR45过表达显著提高了纤毛中的cAMP水平（图6I），表明GPR45转运的Gα_s激活了ADCY3，提高了纤毛中的cAMP水平。

研究人员基于细胞的实验表明，GPR45的功能是将Gα_s转位到初级纤毛中，在初级纤毛中激活ADCY3。为了检测GPR45和ADCY3在体内的遗传互作，研究人员将Gpr45^-/-和Adcy3^-/-小鼠杂交产生单基因敲和双基因敲除动物。然而，Adcy3^-/-小鼠表现出嗅觉障碍，并且在出生后48小时内具有较高的死亡率。在遗传筛选过程中，研究人员发现了Adcy3的一个隐性等位基因，命名为magnificent_frigatebird，它与严重肥胖相关（图S15A、B）。L278H错义突变破坏了ADCY3的腺苷酸环化酶活性（图S15C、D）及其纤毛定位（图S15E、F）。然而，与Adcy3^-/-小鼠不同，Adcy3^L278H/L278H小鼠存活良好。虽然Gpr45^-/-和Adcy3^L278H/L278H单突变小鼠都是肥胖和食欲亢进，但与单突变体相比，Gpr45^-/-; Adcy3^L278H/L278H双突变体小鼠并没有表现出更严重的肥胖或食欲亢进（图6J-L）。同样，在Gpr45^-/-和Adcy3^L278H/L278H单突变体和双突变体小鼠中，高血糖和肝脏脂肪变性的程度是相当的（图S16A-D）。因此，GPR45和ADCY3可能调节食物摄入量的同一信号通路中发挥作用。

扩展阅读：ADCY3

ADCY3，全称为腺苷酸环化酶3（adenylate cyclase 3），是位于人类染色体2p23.3上的一个基因。这个基因编码的蛋白质属于腺苷酸环化酶家族，也被称为AC3。腺苷酸环化酶是一类酶，它们在细胞内负责将ATP转化为cAMP（环磷酸腺苷），这是一个非常重要的第二信使，参与调控多种细胞功能。

ADCY3主要在嗅觉神经元中表达，它的主要功能是催化ATP生成cAMP。在嗅觉系统中，cAMP的生成对于嗅觉受体的激活和信号传导至关重要。具体来说，当气味分子与嗅觉受体结合时，触发一系列构象变化。这些构象变化导致ADCY3被激活，迅速产生cAMP，进而激活离子通道，导致神经元兴奋，最终将嗅觉信号传递到大脑。

在本文中，GPR45定位在室旁核神经元的初级纤毛上，将细胞质中的Gα_s蛋白转运至纤毛中，建立一个Gα_s的“储备库”。MC4R同样位于纤毛上。当来自弓状核的“饱腹”信号（α-MSH）传来时，MC4R则利用Gα_s来激活下游的“信号工厂”ADCY3。只有当GPR45将足量的Gα_s运送到位，MC4R才能高效地工作，激活ADCY3产生cAMP，从而向细胞下达“饱了”的指令。

当上述过程都能顺利进行时，生物体才能正常摄食，而非食欲过盛。若GPR45不能正常定位到纤毛上，也就不能转运足够的Gα_s去响应MC4R进而激活ADCY3产生cAMP，生物体就无法感知饱腹感，最后就会增加摄食量，最终导致肥胖。

由于MC4R与Gα_s偶联，并且MC4R和ADCY3都定位于PVH的神经元纤毛中，使用Mc4r-Cre敲除Gpr45导致肥胖表型（图3R-T、S4J-L），因此GPR45可能通过将Gα_s靶向纤毛来调节MC4R的活性。为了验证这一想法，研究人员使用MC4R特异性抗体来检测Gpr45-GFP敲入小鼠中MC4R⁺和GPR45⁺纤毛的定位。PVH中大部分MC4R⁺纤毛表达GPR45（图6M、N）。在N11细胞中，过表达MC4R及其靶向纤毛的附属蛋白MRAP2会导致MC4R仅定位于纤毛中（图S17C）。然而，尽管纤毛中存在MC4R，Gα_s在纤毛中的定位并没有增加（图S17C），也没有观察到纤毛中cAMP的变化（图6O），正如基于FRET的cAMP传感器所示。与单独过表达GPR45相比，GPR45与MC4R共表达促进了Gα_s向纤毛的转位（图S17A-E），导致纤毛cAMP进一步增加（图6O）。GPR45诱导的MC4R激活导致纤毛的cAMP水平与α-黑素细胞刺激素（α-MSH）刺激MC4R时观察的水平相当（图S17F）。然而，在GPR45过表达的细胞中，α-MSH并没有进一步提高纤毛中的cAMP，这表明配体诱导的MC4R激活可能与GPR45介导的MC4R激活无关（图S17F）。事实上，给Gpr45基因敲除小鼠MC4R激动剂司美格鲁肽降低其的食物摄食量（图S17G）。因此，GPR45以一种独特的方式将Gα_s转运到纤毛中，并在纤毛中被MC4R用来激活ADCY3和提高纤毛的cAMP。

图6 | GPR45靶向Gαs至纤毛，通过ADCY3促进MC4R活化和cAMP产生

图S15 | magnificent_frigatebird (Adcy3L278H)小鼠的鉴定与表征

图S16 | Gpr45^-/-和Adcy3^L278H/L278H单、双突变小鼠的表型

图S17 | GPR45靶向Gαs进入纤毛，促进纤毛MC4R的激活

7. expansive突变和extensive突变都破坏了GPR45的纤毛定位

据预测GPR45是一个七次跨膜的GPCR。expansive突变S214P和extensive突变Y287C分别位于GPR45的第5和第6次跨膜区（图7A）。Y287C和S214P突变均不影响蛋白的稳定性，在293T细胞中过表达时相似的表达水平和模式说明了这一点（图7B）。与WT GPR45一样，Y287C和S214P突变体仍与G⍺_s相互作用（图7B），过表达GPR45-S214P或GPR45-Y287C导致全细胞裂解液中cAMP水平显著降低（图7C）。然而，与WT GPR45相比，GPR45-S214P和GPR45-Y287C未能增加纤毛中cAMP水平（图7D）。此外，GPR45的Y287C和S214P突变体均定位于细胞质中，而在N11细胞中没有观察到纤毛定位（图7E-H）。与纤毛定位的破坏相一致的是，当过表达GPR45-S214P或GPR45-Y287C时，HA标记的G⍺_s不能定位在纤毛中。相反，G⍺_s和GPR45突变体共定位于细胞质（图7I-L）。此外，过表达GPR45-S214P或GPR45-Y287C突变体后，内源性G⍺_s也无法转位到纤毛上（图S18）。因此，虽然突变体将G⍺_s螯合在细胞质中，但它们不能将G⍺_s引导到纤毛上，从而损害纤毛cAMP信号的激活，这突出了纤毛定位在GPR45介导的能量稳态调节中的关键作用。

图7 | CP-A脂肪生成的LIFR-STAT3信号传导要求

图S18 | expansive和extensive的突变破坏了GPR45对内源性Gas的纤毛转位

总结

黑皮质素系统中枢调节能量稳态，其关键因子是神经元初级纤毛中的黑皮质素-4受体（MC4R）和腺苷酸环化酶3（ADCY3）。MC4R和ADCY3的突变以及纤毛功能障碍会导致肥胖，但黑皮质素信号如何在纤毛中发挥作用尚不清楚。利用小鼠随机突变，研究人员发现了G蛋白偶联受体 45（Gpr45）的两个错义突变，它们通过食欲亢进导致肥胖。GPR45在下丘脑室旁核（PVH）中表达，定位于纤毛，并通过ADCY3募集G⍺_s增加纤毛中的环磷酸腺苷（cAMP）。GPR45与PVH纤毛中的MC4R共定位，并促进纤毛MC4R的激活。PVH或MC4R⁺神经元中GPR45的缺失会导致肥胖。这些研究结果表明，GPR45是纤毛黑皮质素系统的关键调节因子，是MC4R和ADCY3之间的桥梁。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adp3989IF: 45.8 Q1