代谢学人

Cell Metabolism：红娘NRTN牵线肌肉-神经“慢-慢”人生路

有规律的运动锻炼有益于身心健康和代谢稳态，在医学上亦具有预防和治疗疾病的作用。因此，鉴定运动相关的有益分子一直是世界范围内众多研究的主要目标。运动对各个器官有着直接或间接影响，因此，通过训练提高代谢表现，不仅依赖于细胞对锻炼的自主适应，还依赖于由不同信号交换协调的器官间的相互作用。

肌肉纤维分泌的运动信号包括蛋白质(肌肉分泌因子)和其他体液因子（humoral factors）如各种代谢物等。许多骨骼肌对运动的反应都被整合到由共激活因子PGC-1（即PGC-1α1及其异构体、PGC-1β）调控的广泛转录程序中。其中，PGC-1α1的相关研究最为深入。骨骼肌特异性过表达PGC-1α1(MCK-PGC-1α1）小鼠的骨骼肌中，PGC-1α1表达水平高出2到6倍。并且在没有任何训练的情况下就表现出良好的耐力运动能力，包括肌肉血管生成的增加，以及线粒体生物合成、氧运输、能量利用和脂肪酸氧化能力等代谢水平的提高。有趣的是，有研究表明骨骼肌特异性MCK-PGC-1α1转基因对慢性轻度应激引起的抑郁症具有抵抗作用，这是因为运动诱导骨骼肌表达 PGC-1α1，通过激活PGC-1α1-PPARα/δ 轴，增加了犬尿氨酸转氨酶表达从而减少血浆中犬尿氨酸浓度，以保护大脑受抑郁症相关的压力引起的变化。这提示了PGC-1α1小鼠的肌肉与其他多器官间存在相互交流。

哺乳动物的骨骼肌是由收缩性和分子特性不同的肌纤维组成的。肌肉纤维根据其代谢、收缩和电特性可分为多种类型，在啮齿类动物躯干和肢体肌肉中，根据它们表达的肌球蛋白重链(MyHC)基因，肌纤维分为四种类型，分别称为I、IIA、IIX、IIB，收缩速度从慢到快。根据肌纤维收缩速度又可以划分为快肌纤维和慢肌纤维。慢肌纤维（I型肌纤维）主要特性是收缩速度较慢，收缩维持的时间较长，耐力较好，其供能来源主要为有氧氧化。快肌纤维（II型肌纤维）与慢肌纤维特点较为不同，它收缩速度快，力量强，肌肉收缩维持的时间较短，耐力差，且其主要供能来源为糖酵解。不同肌纤维类型酶活性的不同决定了其代谢性能的差异。由于Ⅰ型肌纤维含有较高活性的有氧代谢酶 (琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶等) 、线粒体含量高, 而ATP酶活性较低 (与收缩强度相关) , 故收缩慢而持久。相反, Ⅱb型肌纤维中ATP酶和糖酵解酶系活性高、糖原含量高, 而线粒体含量少、有氧代谢酶活性低, 故收缩快但不持久。相比于Ⅰ型肌纤维, Ⅱb型肌纤维直径大、血管化程度低、ATP酶活性较高、抗疲劳性较弱。Ⅱx型纤维特征与Ⅱb型接近, 但其收缩速率略低, 氧化代谢程度较高。Ⅱa型纤维在收缩和代谢方面介于Ⅱx和Ⅰ型之间。4种肌纤维类型的氧化能力由高到低依次为Ⅰ型>Ⅱa型>Ⅱx型>Ⅱb型, 肌纤维收缩速率表现为Ⅰ型<Ⅱa型<Ⅱx型<Ⅱb型。

运动神经元的支配对肌肉正常行使功能至关重要。运动神经元轴突末梢在骨骼肌肌纤维上的接触点被称为肌肉神经接头(NMJ)。从神经纤维传来的信号通过肌肉神经接头传给肌纤维,引起肌肉收缩，同时神经肌肉接头能够维持一定的肌紧张，抑制肌肉萎缩。成年人的运动神经元（motorneuron，MN）根据其所支配肌纤维的类型可分为α、β和γ三类。α-MN支配骨骼肌纤维外表面（Extrafusal muscle fibers），并驱动肌肉收缩。γ-MN支配骨骼肌纤维内膜 (Intrafusal muscle fibers)，在运动控制中的角色较为复杂。第三个定义不明确的神经元群体称为β-MN，它既支配肌纤维内膜又支配肌纤维外表面。α-MN的运动神经元类别最丰富，根据大小、兴奋性、触发模式和传导速度方面的不同又可以分为快型α-MN和慢型α-MN。快型α-MN细胞体和平均膜面积较大，有更多的轴突和树突分支以及更多的突触前神经肌肉末端，信号传导速度快，而慢型α-MN细胞体和平均膜面积较小，含有较少的轴突、树突分支以及突触前神经肌肉接头，信号传导速度慢。肌纤维和连接在肌纤维上神经共同构成了一个运动单位，分为三种主要类型，其中两种抽搐收缩时间相对较短的类型(FF和FR类型)，另一组收缩时间相对较长(S型，其抗疲劳能力极强，根据未融合的形状可与FF和FR单位区分)。在所有三种肌肉单元类型中都观察到强直后的抽搐反应增强。神经支配FF和FR肌肉单位的运动神经元的轴突传导速度分布基本相同，而神经支配S型肌肉单位的运动神经元的轴突传导速度一般较慢。在包括肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩症(SMA)和衰老等多种退化情况下， 快速疲劳型 (Fast-fatigable，FF) 运动单元退化较早，而支配慢速肌纤维的运动神经元退化较慢。每个运动轴突支配一块肌肉内的许多肌肉纤维(通常是几十个)，形成一个运动单元（motor unit），是肌肉收缩的基本单位。值得注意的是，一个运动单元内的所有或几乎所有肌肉纤维都是同一类型的，即使是在多类型纤维混杂的肌肉中，这种显著的特异性被称为运动单位同质性。这表明了运动轴突和肌纤维的选择性匹配。一般来说，肌纤维的代谢和收缩特性与支配该肌肉纤维的MN的特性相耦合会发挥更好的运动协调能力、运动表现和代谢能力。

之前的研究发现突触囊泡蛋白SV2A在出生时广泛表达，在出生后的第一周，快型运动神经元会下调SV2A表达，因此SV2A选择性地表达定位于慢型运动神经元表面，作为慢型运动神经元的分子标记物。而在骨骼肌纤维中过表达PGC1α会导致慢肌纤维增多，有助于提高小鼠耐力，同时在PGC1α过表达的肌纤维中会促进SV2A阳性的慢型运动神经元数目增加，使快型运动神经元向慢型运动神经元转换，这表明肌纤维类型转换对其神经支配具有纤维类型特异性的逆行性影响。肌肉中PGC-1a的表达能够促进神经肌肉接头的重塑，不仅改变突触后的结构，而且调节突触前细胞的形态和功能。表明肌纤维对其神经支配的神经元存在一种特异性逆向调控作用。这种从肌纤维到MN的逆向信号传递机制确保了慢-慢型运动单位得以维持，但这种机制仍然未知。

前期研究表明神经营养因子 (Neurturin，NRTN) 作为一种PGC-1ɑ1调控的骨骼肌分泌因子，可促进体外细胞共培养系统（in vitro microfluidics cell co-culturesystem）中神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)的形成。NRTN是胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）家族的成员之一（小编注：胶质细胞源性神经营养因子是诱导神经元存活、发育和功能的蛋白质家族。其成员包括NGF、BDNF、3NT-3和4NT-4等，这些蛋白质是治疗神经损伤等疾病的潜在药物标靶），在神经损伤后的发育和再生过程中参与肌肉神经突触的成熟。本文中，研究人员证明了小鼠骨骼肌中特异性过表达NRTN足以诱导慢型MN的转换，并且肌肉特异性表达NRTN(HSA-NRTN)的转基因小鼠在很大程度上显示出与MCK-PGC-1ɑ1小鼠类似的表型，包括脂肪含量降低，肌肉氧化代谢、血管生成和运动能力显著提高。此外，HSA-NRTN小鼠和注射AAV8-NRTN的C57bl/6小鼠的代谢参数和运动协调性均得到改善。综上所述，NRTN是一种PGC-1ɑ1介导的肌肉分泌因子，因其具有协调肌纤维及其运动神经元的完整性的功能，故而具有极高的治疗潜力。

前期研究表明，运动激活骨骼肌中PGC-1共激活因子的表达，提高了小鼠的耐力。骨骼肌转录组数据显示，与运动耐力适应性相关的各种PGC-1共激活因子（即PGC-1ɑ1、PGC-1ɑ-b和PGC-1β）以及雌激素相关受体γ高表达（ERRγ是PGC-1的重要转录共激活因子，并能有效诱导骨骼肌氧化代谢），进一步NRTN转录被激活 （图S1A）。相反，在PGC-1ɑ缺失小鼠中，骨骼肌NRTN的表达较低(图S1A)。与PGC-1的作用一致，在8周的自主跑轮运动实验后，小鼠骨骼肌中的NRTN表达升高（图1A）。并且研究人员还发现，与有氧运动能力较低的大鼠相比，有氧运动能力较高的大鼠骨骼肌中的NRTN转录水平较高（图1B）（小编注：高容量跑步和低容量跑步大鼠系(HCR和LCR)来自一个异质性大鼠群体(N:NIH)，其基于未经训练的跑步机跑步能力进行育种者选择。跨代遗传研究表明，这些大鼠的有氧能力是一种遗传特征，LCR大鼠更容易患各种疾病，尤其是代谢紊乱。而对早期HCR大鼠的研究表明，高容量跑步表型的主要驱动因素是骨骼肌氧合的改善）。同样，研究人员观察到在单次高强度冲刺骑行后，人类股外侧肌中NRTN表达较高（图1C）。在BXD小鼠中，骨骼肌中的NRTN表达与运动中最大摄氧量的改善呈正相关，与血糖水平呈负相关（图S1B）。这些结果表明，运动可以激活骨骼肌中NRTN的表达，且NRTN的表达与PGC-1的表达和有氧运动能力正相关。

为了探究骨骼肌中NRTN水平长期升高带来的影响，研究人员构建了骨骼肌特异性NRTN过表达的转基因小鼠模型（HSA-NRTN）。在该小鼠模型中NRTN由人α-肌动蛋白(HSA)启动子调控，其在骨骼肌高表达而在心肌中表达较低 (图1D和S1C) （小编注：HSA为人源α-肌动蛋白启动子，人与小鼠同源，高表达于横纹肌，心脏leakey影响较少。MCK是肌酸激酶启动子，在心肌和骨骼肌中都高表达。二者均可用于构建小鼠骨骼肌特异性过表达小鼠，或者融合表达重组酶形成MCK-Cre和HAS-Cre，可用于构建骨骼肌特异性敲除小鼠）。与Pgc1α1不同的是，在基因表达水平上骨骼肌中NRTN的高表达并不激活突触后NMJ基因程序 (图S1D)。为了评估肌源性NRTN是否影响NMJ形态，研究人员对来自HSA-NRTN小鼠和野生型同窝小鼠的趾短伸肌（FDB）的NMJ进行了免疫组织化学分析，将聚集在突触后膜上的乙酰胆碱受体（AChR）用α-银环蛇毒素标记（小编注：α-银环蛇毒素作为乙酰胆碱的竞争性抑制剂，能与突触后膜上的AChR结合，使受体失去传递兴奋的能力，造成肌肉松弛），MN用突触小泡蛋白2（SV2）抗体和神经丝蛋白（NF）抗体标记（图1E）。结果显示，HSA-NRTN小鼠的NMJ总体积较小，其神经末梢周长较小，并且NMJs突触复杂性降低。AChR簇面积和总突触后膜终板面积（骨骼肌细胞的突触后膜也称终板膜）和周长显著减少，但AChR簇的数量相同（图1F和S1E）。以上结果表明，骨骼肌中NRTN过表达会导致运动单位向慢型转变（slow-type motor units）。

由于HSA-NRTN小鼠中中存在NMJ形态上的变化，研究人员接下来进一步探究了肌源性NRTN对MNs转录重编程（retrograde transcriptional remodeling）的影响。为此，研究人员使用激光捕获显微切割（laser-capture microdissection）技术从HSA-NRTN小鼠和野生型同窝鼠的腰椎脊髓中获得MN胞体(图S1F和S1G)。MN胞体存在不同的大小分布，相比于WT鼠，HSA-NRTN小鼠的低面积胞体数量更多，这和前文中运动神经元的慢型转换结果一致（图S1H）。然后，研究人员使用Smart-seq2技术分析了MNs的转录组（图1G），发现获得的细胞表达高水平的MN标记物，表明获得的细胞的确是MN（图S1I）。通过比较HSA-NRTN和野生型MNs的转录组，研究人员发现有232个差异基因（图1G和S1J）。其中，与野生型对照相比，HSA-NRTN小鼠 MNs中存在156个高表达差异基因，76个低表达差异基因。GO分析显示，这些变化的基因显著的富集在与突触可塑性、神经肽信号和AChR信号相关的通路上（图1H），所以这些基因集主要编码的蛋白质位于树突、轴突末端和前缘。有趣的是，与野生型对照组相比，在HSA-NRTN小鼠变化的top基因中， Chodl (软骨凝集蛋白) 和Calca (降钙素相关多肽) 等几个已知的快型MNs 标记物显著显著下降。进一步分析表明，HSA-NRTN小鼠MNs中大多数快型MN标记物的表达较低，而大多数慢型MN标记物的表达较高（图1I）。qRT-PCR验证结果与上述转录组分析结果一致， HSA-NRTN小鼠腰椎脊髓中快型MN标记物（Chodl、Rspo2、Plxcd1、Layn、Kncq5、Calca、和 Mmp9）低表达，而慢型MN标记物（Prkcd、Esrrb、和Sil1）高表达（图1J）。研究人员进一步分析了HSA-NRTN小鼠和野生型同窝小鼠腓肠肌中SV2a蛋白的水平（SV2a是定位于突触小泡，只在神经元中特异性表达的蛋白，可用于表征突触小泡的数量）。与野生型相比，HSA-NRTN小鼠肌肉中的SV2a蛋白水平高出2倍以上，总SV2 (包括SV2a、SV2b和SV2c)水平较低，突触素蛋白（突触素是一种与突触功能密切相关的膜蛋白）水平相似(图1K和S1K)。前期研究表明，两种MN除了具有不同的触发特性(Firing properties)外，快型MNs在如衰老和肌萎缩性侧索硬化等病理条件下更容易退化。有趣的是，在HSA-NRTN小鼠 MNs中，与MNs抵抗退化相关的基因表达升高，促进退化相关的基因表达降低(图1L)。总之，这些数据表明肌肉来源的NRTN通过改变MNs和NMJs中的转录和形态变化，促进了MN向慢型的转换。

图1.肌源性NRTN促进运动神经元重塑

 扩展数据图1. HSA-NRTN小鼠NMJ与运动神经元重塑

HSA-NRTN小鼠的骨骼肌呈鲜艳的红色或棕色，而较红的纤维一般表征慢收缩的氧化型肌纤维(图2A)。另一方面，相比于野生型小鼠，HSA-NRTN小鼠显示出骨骼肌形态较小，SOL (比目鱼肌)、FDB (趾短伸肌)、Gas (腓肠肌)和TA (胫骨前肌)重量较轻，而胫骨长度、脑和心脏重量没有显著变化(图2B、S2A和S2B)。基于上述HSA-NRTN小鼠NMJ向慢型的转化和骨骼肌颜色的变化，研究人员进一步探究了NRTN是否诱导骨骼肌纤维类型转换。结果显示：在FBD中HSA-NRTN小鼠的慢型I型纤维显著上升， IIx型肌纤维显著减少 (图2C)。在SOL中存在更多的I型纤维(图2D)。在TA中，IIb型肌纤维也呈现出向IIx型肌纤维转化的趋势(图2E)。此外，HSA-NRTN小鼠的纤维横截面积(CSA)分布也显示小型肌纤维出现的频率更高，且FDB(图2F)、SOL(图2G)和TA(图2H)的平均CSA也降低了。上述的检测结果表明，HSA-NRTN小鼠的骨骼肌较轻，肌纤维面积减少，且呈现向慢肌纤维转换的特征。

除了上述肌肉收缩蛋白（muscle contractile proteins）和MN的转换，钙调控也是肌纤维类型转换的重要表征条件。研究人员观察到GAS和FBD中钙调控相关的多种分子都发生了显著的表达变化(图S2D-S2F)。将这些变化与前人的SOL和EDL基因芯片结果 (SOL主要代表慢肌，EDL主要代表快肌)比对发现，NRTN过表达后，慢肌中的钙调控分子的表达升高，并抑制了快肌中钙调控分子的表达(图S2D)。这些结果表明，骨骼肌中NRTN的过表达促进了骨骼肌纤维由快肌向慢肌转化。

图2. NRTN诱导骨骼肌肌纤维类型转换

扩展数据图2.HSA-NRTN小鼠骨骼肌收缩和钙调控机制的转录重编程

为了评估HSA-NRTN小鼠骨骼肌线粒体功能的潜在变化，研究人员用四唑蓝染色(Tetrazolium Blue Stain) 分析了NADH脱氢酶和琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性（小编注：NADH脱氢酶位于线粒体内膜，它能催化电子从NADH传递给辅酶Q，也称复合物Ⅰ，因此它是一种线粒体标志酶。另外琥珀酸脱氢酶（也称复合物Ⅱ）与线粒体内膜紧密结合，能催化电子从琥珀酸传递到辅酶Q，其活性反映三羧酸循环情况，是三羧酸循环标志酶，也是线粒体标志酶。两种酶都是脱氢酶，因此它们的活性均可通过四唑盐检测。四唑盐作为脱氢酶反应中的受氢体，接受脱氢酶作用于底物所释放的氢而形成蓝紫色的甲䐶(formazane)，沉积于酶所在部位。这两种组织化学染色法可根据氧化能力不同将肌纤维分为I型和II型肌纤维，I型肌纤维的氧化酶含量高于II型，因此I型肌纤维呈深蓝紫色，II型肌纤维可依据染色深浅分为IIa型和IIb型，Ⅱa型染色后呈蓝紫色，IIb型呈淡蓝紫色）。在野生型小鼠肌肉中，研究人员观察到两种脱氢酶的正常活性，即同时存在高氧化型肌纤维(深蓝色)和低氧化型肌纤维(白色或浅蓝色) (图3A)。然而，几乎所有来自HSA-NRTN小鼠的肌纤维都表现出很高的琥珀酸和NADH脱氢酶活性(图3A和S3A)。重要的是，来自HSA-NRTN小鼠和对照鼠的同类型肌纤维在CSA上没有差异 (图S3B)，即只要是NADH脱氢酶阳性肌纤维无论其是来源于HSA-NRTN小鼠还是对照鼠，它的CSA是没有差异的（把两组小鼠的高氧化活性的肌纤维对比，它们的CSA没有差异。而定量所有的肌纤维后，发现肌纤维转换后的平均CSA减小，即面积小的肌纤维增多，面积大的肌纤维减小）。这说明HSA-NRTN小鼠骨骼肌中存在肌纤维类型的转化但是同种类型的肌纤维功能并未被减弱。此外，在HSA-NRTN小鼠骨骼肌中，通常与骨骼肌萎缩相关的多个基因的表达要么没有变化，要么明显降低(图S3C和S3D)。因此，这些数据表明，HSA-NRTN小鼠中面积较小的肌纤维是由于纤维的收缩和代谢特性的改变，即肌纤维类型转换影响肌肉大小，而不是由肌肉萎缩引发的。与上述结果一致的是 HSA-NRTN小鼠的骨骼肌的所有线粒体电子传递链（ETC）复合体的蛋白质水平都较高(图3B和S3E)，这提示了HSA-NRTN小鼠骨骼肌存在更高的氧化效率。接下来，为了评价外源性NRTN能否改善骨骼肌细胞线粒体功能，研究人员用重组NRTN蛋白(rNRTN)处理完全分化的小鼠原代肌管细胞，并测定线粒体呼吸。结果显示，用rNRTN处理的肌管显示出更高的基础呼吸量和最大呼吸量(图3C和S3F)。上述结果在体内体外两个方面证明了NRTN可以提高骨骼肌氧化效率。

线粒体氧化能力的增强也增加了骨骼肌对氧气和营养供应的需求。因此，研究人员试图确定肌肉NRTN的表达是否也激活了血管生成，从而增加了组织的血液供应。通过用抗CD31抗体对HSA-NRTN小鼠骨骼肌横切面进行染色，研究人员发现HSA-NRTN小鼠存在更高的毛细血管密度(图3D)，每平方毫米的毛细血管数大约是野生型小鼠的3倍(图3E)。且尽管HSA-NRTN小鼠的CSA小的肌纤维占比较多，但其骨骼肌中每根纤维的毛细血管数量增加了63%(图3E)。HSA-NRTN骨骼肌基因表达分析显示血管内皮生长因子(VEGF)A和B水平较高(图3F)。综上结果表明NRTN增强了骨骼肌线粒体的功能和血管生成能力，其存在更高的氧化能力和氧营养供应能力。

图3. NRTN能增强线粒体功能和血管生成

4.NRTN对糖脂代谢的转录重编程调控具有相反的效应

为了更好地了解NRTN如何影响骨骼肌功能和代谢，研究人员通过对两组小鼠的腓肠肌进行RNA测序，进而对基因表达进行了全面分析。研究人员在HSA-NRTN小鼠的骨骼肌中观察到大量转录重编程，其中有3418个转录本被显著诱导，3366个转录本被显著抑制(图4A和S4A)。GO功能富集分析表明参与能量代谢、肌肉稳态/收缩和炎症应答的基因显著富集(图4B)，与NRTN促进慢型纤维类型组成和钙调控的变化一致，研究人员观察到在HSA-NRTN小鼠的骨骼肌中，一般在快肌中富集的收缩蛋白的异构体[例如肌球蛋白结合蛋白C2(Mybpc2)]受到显著抑制，同时在慢肌或心肌中收缩蛋白富集的异构体(例如Mybpc1)上调(图S4B)。此外，通过分析参与能量代谢的通路，研究人员发现NRTN的高表达对葡萄糖和脂肪代谢具有相反的转录调控效应(图4C)。绝大多数糖酵解和糖原分解基因在HSA-NRTN骨骼肌中的表达较低，然而与脂肪酸摄取(例如Lpl和CD36)、细胞内转运(例如Fabp3和Cpt1a)以及β-氧化(例如Acadm和Acadl)相关的基因在HSA-NRTN骨骼肌中被诱导表达，同时TCA循环的大多数酶也是高表达（小编注：脂肪分解后的产物脂肪酸经β-氧化后生成乙酰CoA以及甘油，而甘油可以在甘油激酶作用下接受ATP的磷酸基团形成3-磷酸甘油，再脱氢形成磷酸二羟丙酮（DHAP），从而进入EMP途径，最终生成乙酰CoA，然后经过TCA循环而被彻底氧化，故而脂肪酸代谢增高会伴随着TCA增强）。研究人员还观察到编码各种ETC复合体亚基的基因表达也有升高的趋势(图S4C)。这表明NRTN在调控骨骼肌糖脂代谢基因表达方面功能截然相反。

此外，上述结果也表明在HSA-NRTN小鼠中观察到的表型与骨骼肌特异性PGC-1ɑ1转基因小鼠模型中观察到的表型非常一致。为了确定NRTN在骨骼肌中引起的转录变化与MCK-PGC-1ɑ1带来的转录变化有何重叠，研究人员将之前的测序数据与已发表的MCK-PGC-1ɑ1小鼠骨骼肌基因测序数据进行了比较。结果发现，在MCK-PGC-1ɑ1小鼠中差异表达的基因(与野生型相比)中，超过一半的基因在HSA-NRTN小鼠肌肉中也呈现出差异表达(图S4D)。GO分析表明，重叠的部分主要富集于参与各种代谢途径的基因，包括脂肪酸氧化、TCA循环和糖原生物合成。同时参与兴奋-收缩耦合的通路也被富集，如肌肉收缩、电偶联和肌浆网（心肌和骨骼肌细胞中的一种特殊的内质网，其功能是参与肌肉收缩活动）的钙释放。而线粒体发生的基因仅在MCK-PGC-1ɑ1小鼠中富集，表明PGC-1ɑ1是比NRTN更强的线粒体生物发生激活因子。尽管与PGC-1ɑ1调控的基因程序有很强的重叠，但HSA-NRTN小鼠中仍有4472个基因差异表达。值得注意的是，与MCK-PGC-1ɑ1肌肉中使用的基因芯片相比，本文的RNA测序具有更高灵敏度和动态范围，这可能导致HSA-NRTN小鼠基因集中出现大量差异表达基因。这些基因主要富集于与免疫细胞功能相关的过程，特别是辅助T细胞(Th)谱系。有趣的是，研究人员观察到抗炎性Th2和Treg细胞谱系的标记物表达更高，而促炎性Th1和Th17标记物表达更低(图S4E)。综上所述，HSA-NRTN小鼠的肌肉表现出与MCK-PGC-1ɑ1小鼠部分重叠的转录特征，并能更好地促进肌肉细胞进行脂肪酸氧化和线粒体呼吸。

图4. HSA-NRTN骨骼肌的RNA测序分析

扩展数据图4. HSA-NRTN小鼠骨骼肌的RNA测序分析

上述研究表明NRTN能促进MNs和肌肉纤维的协调性变化。为了评估这些变化对肌肉功能的影响，研究人员对两组小鼠进行了一系列的肌肉功能测试。结果发现，HSA-NRTN小鼠的运动协调能力有显著改善。在转棒试验中，HSA-NRTN小鼠不仅第一天的表现显著优于野生型小鼠，而且在随后几天的试验中表现出更大的平衡能力改善(图5A)，并且这种改善与体重无关(图S5A)。此外，在进行跑步机运动能力测试时，HSA-NRTN小鼠的跑步量是野生型小鼠的两倍(图5B)。另一方面，与野生型小鼠相比，HSA-NRTN小鼠的握力较低，这与肌肉大小和纤维类型组成的变化是一致的(图5C) (小编注：骨骼肌纤维类型按照收缩速度可分为快肌纤维和慢肌纤维，较之慢肌纤维，快肌纤维直径粗，且其收缩速度、收缩力量较强；而慢肌纤维中线粒体多且体积大，抗疲劳性强；也就是说，快肌纤维含量较多的肌肉越大。小鼠在转棒实验中持续时间越长，说明其抗疲劳能力越强，也意味着其慢肌纤维含量越高；在跑步实验中，小鼠跑步时间越久，说明其耐力越强，则小鼠慢肌纤维含量越高；在握力实验中，小鼠握力越强，则代表其收缩力量越强，快肌纤维含量越多，肌肉越大)。为了进一步评估NRTN对肌肉收缩特性的影响，研究人员分析了SOL和EDL的离体收缩力和疲劳指标。在HSA-NRTN小鼠的SOL中，研究人员观察到给予50Hz以上的电刺激而产生的绝对力量（absoluteforce）较野生型小鼠组低(图5D)，这种绝对力量上的减少完全是由于SOL质量降低(图S5B)。然而HSA-NRTN小鼠的SOL在15-30Hz时显示出更高的相对力量（specificforce，绝对力量比上CSA为相对力量），随后达到与野生型小鼠相似的水平。在EDL上，HSA-NRTN小鼠的肌肉在50Hz以上的刺激下显示出较低的绝对力量和相对力量，这表明EDL的纤维收缩力与CSA无关(图5E和S5B)。关于肌纤维疲劳性，HSA-NRTN小鼠SOL的疲劳速度与野生型相同，但恢复要快得多(图5D)。另一方面，HSA-NRTN小鼠的EDL保持收缩力的时间更长，恢复速度与野生型相同(图5E)。综上所述，肌肉来源的NRTN引发肌肉特有的收缩特性变化，这有助于运动协调性和运动表现的整体改善。

图5. HSA-NRTN小鼠增强运动协调性和运动能力

扩展数据图5. NRTN提高运动协调性和运动能力

骨骼肌的代谢状态对全身能量稳态有着广泛的影响。由于NRTN对骨骼肌收缩和代谢特性有着巨大影响，研究人员进一步确定肌源性NRTN对能量稳态的全身影响。与野生型小鼠相比，HSA-NRTN小鼠体重更低(图6A)，瘦体重百分比更高(图6B)，脂肪百分比更低(图6C)，但骨密度(图6D)和胫骨、股骨长度(图S6A)没有差异。与体脂较低一致，HSA-NRTN小鼠附睾白色脂肪组织(eWAT)和棕色脂肪组织(BAT)质量较低(图6E-6G)。为了进一步了解肌肉分泌的NRTN对全身能量稳态的影响，代谢笼结果表明，HSA-NRTN小鼠和野生型小鼠的食物消耗(图S6B)、运动能力(图S6C)和呼吸交换率(图S6D)相似。为了进一步探究两组小鼠体重存在差异的原因，研究人员对监测的各种代谢参数进行了协方差分析。然而，研究人员观察到氧气消耗（图6H）、二氧化碳产生（图6I）、能量消耗（图6J）或能量平衡（图S6E）的统计没有任何显著变化，表明两者在能量代谢上并无差异，说明骨骼肌过表达NRTN不影响能量代谢功能。尽管在HSA-NRTN小鼠的iWAT中几种米色脂肪细胞标记物的表达更高（图S6G），但研究人员并没有在eWAT（图S6F）、iWAT（图S6G）或BAT（图S6H）中观察到产热基因程序的转录激活。在葡萄糖稳态方面，尽管HSA-NRTN小鼠喂食后的血浆胰岛素水平较低（图6L），空腹血浆胰岛素水平不变（图S6I），但它们的葡萄糖耐量有所改善（图6K）。同时研究人员检测到HSA-NRTN小鼠骨骼肌中葡萄糖转运体SLC2A4（GLUT4）的蛋白表达水平较高（图6M）。此外HSA-NRTN小鼠的腓肠肌糖原含量低于野生型小鼠（说明机体葡萄糖代谢能力增强）（图S6K）。综上结果表明肌源性NRTN通过改善肥胖表型和葡萄糖稳态，不影响脂肪组织的棕色化表型。

图6. HSA-NRTN小鼠改善肥胖表型和葡萄糖稳态

扩展数据图6.HSA-NRTN小鼠的代谢特征

为了进一步研究NRTN在骨骼肌中介导的分子机制，研究人员对HSA-NRTN小鼠和野生型小鼠的骨骼肌进行了活性激酶分析（Activity-BasedKinaseProfiling）。与野生型小鼠肌肉相比，研究人员观察到HSA-NRTN小鼠骨骼肌中42个酪氨酸激酶底物肽和15个丝氨酸/苏氨酸激酶底物肽的磷酸化水平显著升高(图S7A)。有趣的是，变化差异最大的磷酸化肽之一是来自RET酪氨酸激酶的肽，它是NRTN的辅助受体(图S7A)。通过计算分析这些磷酸化肽的特性来评估激酶活性(图7A)。HSA-NRTN小鼠骨骼肌活性较高的激酶包含多种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，包括MAPK1(ERK2)、MAPK3(ERK1)、MAPK8-10(JNK1-3)和MAPK14(p38)(图7A和S7B)。研究人员进一步使用STRING构建了蛋白-蛋白相互作用网络，如图7B所示，产生了一个以MAPK和SRC激酶家族成员为中心的相互连接的网络。这个网络的核心是ERK2和SRC激酶，它们都是神经元中NRTN受体的下游信号。有趣的是，差异基因(激活激酶)的通路分析结果显示，轴突导向（AxonGuidance）是HSA-NRTN小鼠肌肉激酶网络中最丰富的通路之一（图7C）。和蛋白互作网络结果一致，轴突导向的互作网络也以SRC激酶和MAPKs为中心，特别是ERK2和p38(图S7C)。除了通过GFRα2:RET信号和下游级联传递信号外，NRTN还可以通过神经细胞粘附分子(NCAM)传递信号。值得注意的是，HSA-NRTN小鼠肌肉中RET和NCAM下游的激酶都展现出更高的活性，并且两个分支都集中在ERK1/2上(图7D)。综上这些数据表明，NRTN可以激活骨骼肌中与神经元中相同的级联信号通路（小编注：前期研究表明NRTN作为一种PGC-1ɑ1调控的骨骼肌分泌因子，可促进体外细胞共培养系统中神经肌肉接头的形成）。

上述研究结果表明NRTN信号同时传递给MNs和肌纤维。事实上，NRTN的主要受体GFRα2在体外培养的小鼠原代肌管细胞中表达，并且其表达在整个肌管分化过程中增加(图S7D)。为了测试rNRTN是否能直接作用于肌肉细胞，研究人员用rNRTN处理完全分化的小鼠原代肌管细胞，并通过免疫印迹方法检测不同时间点的蛋白质磷酸化情况。结果发现，rNRTN处理可诱导ERK1/2及其下游靶标cAMP-反应元件结合蛋白（CREB）的迅速磷酸化，但对SRC家族激酶的磷酸化状态影响不大（图7E）。除了RAF/MEK/ERK途径外，RET还激活多种其他下游效应器，包括AKT信号转导因子及转录激活因子3（STAT3）。在培养的肌管细胞中，rNRTN处理可激活AKT并诱导STAT3在丝氨酸727位点的磷酸化，这主要与其线粒体活性有关。有趣的是，rNRTN同时降低了STAT3酪氨酸磷酸化，这主要与其核转录活性有关。这些结果表明，除了之前报道的NRTN在神经元中的作用，NRTN还可以激活骨骼肌细胞中其受体下游的信号传导。

肌源性因子NRTN对肌肉生理和全身代谢有明显的益处并具有潜在的治疗价值。为了评估系统性递送NRTN是否可以产生类似的益处，研究人员将携带全长NRTN及对照的腺相关病毒载体（AAV8）通过尾静脉注射递送至肝脏(图7F)。这种方法会在肝脏中实现NRTN的高表达并分泌到血浆中。与注射对照AAV8的小鼠相比，AAV8-NRTN组小鼠的葡萄糖耐量得到改善(图7G)。并且AAV8-NRTN还改善了小鼠平衡能力(图7H)。但是研究人员没有观察到体重(图7I)和体脂成分(图7J和7K)的显著差异(图S7E)。尽管研究人员无法直接检测血液循环中的NRTN水平，但研究人员在注射AAV8-NRTN的小鼠骨骼肌中检测到较高水平的NRTN蛋白，而骨骼肌NRTNmRNA表达降低(图S7F–S7G)。此外，NRTN显著激活了ERK1/2磷酸化水平(图7E)，并且MyHC-IIx蛋白水平升高(图S7H)。这些数据表明，体外递送NRTN可以靶向骨骼肌，改善运动协调性和葡萄糖稳态。

图7. NRTN激活骨骼肌中的RET信号

扩展数据图7. HSA-NRTN骨骼肌中的激酶活性图谱

 总结

耐力运动促进骨骼肌血管生成、氧化代谢、纤维类型转换并改善神经肌肉接头完整性。研究表明骨骼肌纤维的代谢和收缩特性与运动神经元(MN)的特性相联系能发挥更优良的骨骼肌能力。研究人员证明了肌源性神经营养因子(NRTN)作用于肌肉纤维和MN来耦合它们的特性。通过使用骨骼肌特异性NRTN转基因小鼠(HSA-NRTN)和MN体细胞的RNA测序，研究人员发现NRTN会促进MN向慢型MN转变。在肌肉中，NRTN表达增加了毛细血管密度和氧化能力，并诱导了有利于脂肪酸代谢而不利于糖酵解的转录重编程。这种骨骼肌纤维和MNs的益处相结合，使得HSA-NRTN小鼠体重降低，具有显著改善的运动能力和运动协调性。

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