原名：Dietary glycyl-glutamine supplementation ameliorates intestinal integrity, inflammatory response, and oxidative status in association with the gut microbiota in LPS-challenged piglets

译名：日粮中添加二肽甘氨酰谷氨酰胺可改善LPS刺激仔猪肠道菌群的肠道完整性、炎症反应和氧化状态

期刊：Food & Function

IF：4.171

发表时间：2021.3.8

通讯作者：马立保

通讯作者单位：华中农业大学动物科学与技术学院农业微生物学国家重点实验室

1 日粮中添加GlyGln对LPS刺激引起的回肠损伤的影响

为了确定饮食中添加GlyGln对LPS刺激诱导的肠完整性损伤的影响，研究者使用H&E染色和蛋白质印迹分析评估了回肠形态和屏障完整性。与对照组相比，LPS刺激损伤了回肠形态(图1A)，降低了绒毛高度(图1B)，增加了隐窝深度(图1C)，降低了绒毛高度/隐窝深度比(图1D)，并降低了紧密连接蛋白claudin的表达(图1E)。膳食补充GlyGln改善了脂多糖刺激引起的回肠形态和屏障功能的损伤。

图1.H&E染色和蛋白质印迹分析评价回肠形态和屏障完整性。(A)代表性的回肠切片，(B)绒毛高度，(C)隐窝深度，(D)绒毛高度/隐窝深度比，(E)紧密连接蛋白ZO-1和claudin的蛋白质印迹分析。比例尺200μm；*p< 0.05，**p < 0.01，*** p< 0.001数据表示为平均数±SEM(n=5)。

图2.日粮中添加GlyGln改善由LPS刺激诱导的回肠炎症反应和氧化应激。（A）回肠中炎症细胞因子IL-6、（B）IL-1β、（C）TNF-α和（D）IL-10NOS(tNOS, iNOS, and cNOS)和（E）氧化状态指数，包括（F）GSH-px、（G）SOD、（H）T-AOC和（I）MDA。显著性表示为* p<0.05，** p<0.01，** p<0.001数据表示为平均数±SEM(n=5)。

2 日粮中添加GlyGln对回肠炎症和氧化状态的影响

LPS刺激增加了促炎细胞因子IL-1β(图2B)和TNF-α(图2C)，但降低了抗炎细胞因子IL-10(图2D)。日粮补充GlyGln能恢复抗炎细胞因子IL-10的水平，表明日粮补充GlyGln能改善由LPS刺激诱导的回肠炎症反应。这种炎症宿主反应产生的活性物质，如一氧化氮(NO)，当释放到肠腔中时，迅速转化为硝酸盐。富含硝酸盐的发炎肠道将赋予大肠杆菌生长优势，大肠杆菌具有硝酸盐还原酶基因，而其他细菌物种，如梭菌属和拟杆菌属则没有。LPS刺激增强了tNOS和iNOS(图2E)，这表明一氧化氮合成提高。相反，日粮中添加GlyGln会降低iNOS。此外，发炎肠道的渗漏屏障有助于氧气进入肠道腔，这由更高的血流量增强，并将导致氧化应激，这是由降低的SOD和T-AOC以及增加的MAD支持的，这些都通过饮食中补充GlyGln得到恢复(图2F-1)。因此，日粮中添加Gly-Gln改善了由LPS攻击诱导的回肠炎症和氧化应激。

图3.日粮中添加Gly-Gln恢复了因LPS刺激而改变的肠道微生物群的结构和多样性。(A)组间共同/唯一的OTUs。(B)基于OTU丰度未加权的UniFrac PCoA图所呈现的结构变化(β多样性)。(C-F)α多样性指数观察到的物种，Chao1，ACE，Shannon，Simpson和Good-coverage。显著性表现为* p<0.05数据表示为平均数±SEM(n=5)。

3 日粮中添加GlyGln对肠道微生物群落结构和多样性的影响

为了探索肠道微生物群在通过饮食补充GlyGln改善回肠炎症和氧化状态中的作用，研究者使用16SrDNA扩增子高通量测序(n=5)分析了肠道微生物群的组成。在这些组中，与LPS组相比，GlyGln组与Ctrl组共享更多的OTU(图3A)，表明GlyGln+LPS组的肠道微生物群结构与Ctrl组比LPS组更相似，这进一步得到了PCoA的支持(PC1和PC2占变异的67.68%)，这表明LPS组形成了一个明显不同于对照组和GlyGln+LPS组的明显聚类(图3B)。对于单个样本，α多样性指数(图3C-F)显示，LPS降低了肠道微生物群的α多样性，但只有ACE达到统计显著性(图3E)。日粮补充GlyGln提高了α多样性指数，尤其是ACE(图3C-F)。因此，当日粮中补充GlyGln能改善由LPS刺激引起的回肠炎症和氧化应激时，肠道微生物群发生了改变。

图4.日粮添加GlyGln对肠道微生物相对丰度的影响。肠道微生物群在(A)门、(B)科、(C)属和(D)种水平上的相对丰度。(E)差异细菌的相对丰度变化。显著性表示为* p<0.05数据表示为平均数±SEM(n=5)。

4 日粮添加GlyGln对肠道微生物群分类组成的影响

研究者选择了门、科、属和种的常用分类层级。连接条形图显示，LPS的刺激明显改变了不同分类单元水平上细菌的相对丰度，而这种改变是通过日粮补充GlyGln而恢复的。具体来说，LPS的刺激增加了大肠杆菌和密螺旋体，但减少了考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、梭菌属（Clostridium）、拉克氏菌属、毛螺菌属（Lachnospira）、罗斯氏菌（Roseburia）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）和协同菌和螺旋体门，日粮中添加GlyGln恢复了这些变化，但除了S24-7(图4E)外，没有达到统计学显著性。

图5.日粮添加GlyGln改变了肠道微生物群的功能和代谢物。(A)ctrl与LPS和(B)LPS与GlyGln +LPS肠道微生物群的功能组成。给出了p值小于0.05的功能途径。肠道微生物代谢产物短链脂肪酸包括(C)乙酸、(D)丙酸、(E)丁酸、(F)异丁酸、(G)异戊酸和(H)戊酸。显著性表示为* p<0.05，** p<0.01数据表示为平均数±SEM(n=5)。

5 日粮中添加GlyGln对肠道微生物群功能和代谢产物的影响

为了深入了解功能改变如何响应肠道微生物群的结构变化，本研究者使用PICRUSt2研究了肠道微生物群的功能，并进一步用STAMP软件分析了它们的差异。与对照组相比，LPS刺激降低了膜转运、细胞运动、碳水化合物代谢和信号转导的功能，但增加了复制和修复、翻译、核苷酸代谢、辅因子和维生素代谢、萜类化合物和聚酮化合物代谢以及折叠、分类和降解的功能(图5A)。日粮中添加GlyGln能恢复LPS刺激引起的肠道微生物群的功能转移，即降低复制和修复、辅因子和维生素代谢、翻译、核苷酸代谢的功能，增加碳水化合物代谢和脂质代谢的功能(图5B)。在肠道微生物群的这些转移功能中，碳水化合物代谢功能负责严格厌氧环境下碳水化合物的肠道微生物发酵，以产生有益于宿主的短链脂肪酸。因此，日粮中添加GlyGln可恢复因LPS而降低的回肠SCFA中丙酸和丁酸的浓度(图5C-H)。

图6.用炎性细胞因子、氧化状态、回肠形态和肠道微生物代谢物SCFAs的指数显著校正了差异细菌。通过LEfSe鉴定的单个群体的标记分类群，用于（A） ctrl vsLPS和(B) LPS vs GlyGln + LPS。（C）Spearman秩相关系数的热图以及不同细菌、标记分类单元和炎性细胞因子、氧化状态指数、回肠形态指数和肠道微生物代谢物SCFAs之间的显著性检验。（D）Spearman秩相关系数的热图和肠道微生物代谢物SCFAs与炎症细胞因子、氧化状态指数、回肠形态指数之间的显著性检验。蓝色代表负相关，红色代表正相关。显著性表示为 *p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001数据表示为平均数±SEM(n=5)。

6 鉴别细菌与检测指标的相关性

然后，本研究者使用Spearman等级相关系数和显著性检验评估了不同细菌、标记分类和炎性细胞因子、氧化状态指数、回肠形态指数和肠道微生物代谢物SCFAs之间的相关性。将红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、红蝽菌目(coriobacteriales)、和红蝽菌纲(coriobacteriia)确定为Ctrl的标记分类单元(图6A)；拟杆菌科（Bacteroidaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）和丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi）作为LPS标记分类单元(图6A和B)；雷沃氏菌科（Prevotellaceae）和韦荣氏菌科（Veillonellaceae）作为GlyGln+LPS的标记分类单元(图6B)。

对于炎性细胞因子，丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi）,丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）和拟杆菌科（Bacteroidaceae）与IL-6呈正相关；丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi）和丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）与TNF-α呈正相关，而考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）和罗斯氏菌（Roseburia）与TNF-α呈负相关；Synergistetes、螺旋体科和螺旋菌属与IL-10呈正相关，而（Erysipelotrichi）和丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）与IL-10呈负相关。

在氧化状态方面，考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）,罗斯氏菌（Roseburia）,毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）, 协同菌，螺旋体科和螺旋菌属与T-AOC呈正相关，而拟杆菌科与T-AOC呈负相关；丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi）,丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）与MAD呈正相关，考拉杆菌属（Phascolarctobacterium），毛螺菌属（Lachnospira），毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）, 协同菌，螺旋体科和螺旋菌属与MAD呈负相关，丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi）,丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）和韦荣氏菌科（Veillonellaceae ）与tNOS呈正相关，红蝽菌目(coriobacteriales)、和红蝽菌纲(coriobacteriia)，协同菌，螺旋体科和螺旋菌属与tNOS呈负相关；丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi）,丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）和韦荣氏菌科（Veillonellaceae ）与iNOS呈正相关，而红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、红蝽菌目(coriobacteriales)、和红蝽菌纲(coriobacteriia),协同菌，螺旋体科和螺旋菌属与iNOS呈负相关；

对于肠道微生物代谢物SCFAs，蝽菌目(coriobacteriales)、和红蝽菌纲(coriobacteriia)呈正相关，而韦荣氏菌科（Veillonellaceae ）与乙酸呈负相关；韦荣氏菌科（Veillonellaceae ）与异戊酸负相关；丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi），丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）和韦荣氏菌科（Veillonellaceae ）与丙酸和丁酸呈负相关。

回肠形态方面，丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi）和丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）与隐窝深度呈正相关，而蝽菌目(coriobacteriales)和考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）与隐窝深度呈负相关；考拉杆菌属（Phascolarctobacterium），罗斯氏菌（Roseburia）和毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）与绒毛高度呈正相关；考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）与绒毛高度/隐窝深度之比呈正相关，而丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi）, 丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）和韦荣氏菌科（Veillonellaceae ）与绒毛高度/隐窝深度之比呈负相关。

总的来说，用炎性细胞因子、氧化状态、回肠形态和肠道微生物代谢物SCFAs的指数对差异细菌进行了密切校正(图6C)。鉴于SCFAs有利于肠道屏障、炎症反应和氧化状态，研究者还使用Spearman秩相关系数和显著性检验确定了肠道微生物代谢物SCFAs与炎症细胞因子、氧化状态指数和回肠形态指数之间的相关性。丙酸与IL-1β、iNOS和MAD呈负相关，但与绒毛高度/隐窝深度之比呈正相关。丁酸与TNF-α、 tNOS、iNOS、MDA和隐窝深度呈负相关，但与IL-10 和绒毛高度/隐窝深度之比呈正相关。异丁酸与T-GSH呈负相关(图6D)。

在断奶过渡期间，早期断奶仔猪遭受了断奶应激诱导的肠道微生物群失调和断奶后肠道感染，这导致了小肠的完整性损伤和病理性疾病。补充辅助功能性氨基酸是改善宿主疾病的一种成本有效的方法。这里，研究表明在断奶过渡期间(从28天到48天龄)饮食中补充GlyGln改善了断奶仔猪的小肠损伤、炎症反应和氧化状态。与本研究结果相比较，蒋等报道了在日粮中添加GlyGln两周(14-28日龄)改善了LPS刺激的断奶仔猪的生长性能、免疫反应和肠道完整性。肠上皮屏障缺陷是肠道炎症反应的重要致病因素。日粮中添加GlyGln的有益功能主要归因于GlyGln作为促进其屏障功能的小肠代谢资源。此外，谷氨酸能减轻肠损伤，维持雷帕霉素的哺乳动物靶位，并抑制LPS刺激的断奶仔猪的Toll样受体4和核苷酸结合寡聚结构域信号通路。与这些报告一致，本研究发现日粮中添加GlyGln能通过恢复抗炎细胞因子IL-10的水平来改善LPS诱导的回肠炎症反应。此外，活性氧是在炎症疾病进展中起重要作用的关键信号分子。小肠的上皮屏障缺陷和炎症反应促进活性物质如一氧化氮和氧气释放到肠腔中，从而导致氧化应激。日粮中添加GlyGln通过增加SOD和降低脂质过氧化产物MDA来减轻仔猪的氧化应激，这可能是因为GlyGln对改善肠屏障功能的作用。在大鼠和断奶仔猪中已经观察到了通过在日粮中添加GlyGln来改善肠道抗氧化剂。总之，在断奶过渡期间日粮添加GlyGln增强了仔猪在LPS刺激后的肠道屏障功能和抗氧化能力。

活性氧发生在发炎的肠道中，导致肠道微生物群失调。、肠道微生物群，作为细菌、真菌、病毒和其他微生物和真核物种的集合，对氧极其敏感，因此肠道内腔中的分布与宿主组织提供的氧的分布有关。特别地，宿主来源的硝酸盐和活性氧赋予需氧和兼性厌氧微生物比发炎肠道中专性厌氧细菌的生长优势。在本研究中，日粮中添加GlyGln可恢复因LPS刺激而增加的NOS浓度，包括调节NO合成的tNOS和iNOS。低水平的NO，归于cNOS形式，可有益于细胞功能，而过量的NO产生，与iNOS表达有关，对宿主和肠道微生物群有害。iNOS是在炎症过程中诱发的，并在患有坏死性小肠结肠炎的仔猪中增加。肠腔中活性物质或氧的增加导致肠道微生物群的生物失调，其特征是专性厌氧菌(如梭菌属)的代表显著减少，以及兼性厌氧菌(如肠杆菌科和大肠杆菌属)的相对丰度增加。

本研究数据显示LPS刺激深刻地改变了肠道微生物群的结构，并减少了OTU数和α多样性。在样本量为5的组中，组内α多样性指数的值变化太大，无法达到统计学显著性。GlyGln组富集细菌主要为厌氧菌和产SCFA的菌，包括毛螺菌属（Lachnospira），考拉杆菌属（Phascolarctobacterium），罗斯氏菌（Roseburia），毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）和协同菌。这些细菌的丰度变化是由碳水化合物代谢的肠道微生物群功能的增加所支持的，这些功能负责在严格厌氧环境下碳水化合物的肠道微生物发酵以产生SCFA。

因此，日粮中添加GlyGln能恢复因LPS刺激而降低的回肠SCFA中丙酸和丁酸的浓度。据报道，另外两种GlyGln组富含的细菌S24-7和螺旋体在糖尿病敏感小鼠中更为丰富，并且随着膳食蛋白质浓度的降低而急剧减少。相反，日粮中添加GlyGln降低了肠道异常痢疾猪粪便中富集的机会性病原体密螺旋体。相应地，日粮中添加GlyGln提高了受LPS刺激而降低的SCFA(包括丁酸和丙酸)的浓度。相关性分析和显著性检验进一步表明，这些GlyGln富集的厌氧菌和产SCFA菌对SCFA的增加有显著贡献。SCFA，如丙酸和丁酸，是厌氧发酵的主要终产物，不仅有益于肠道屏障，还能改善炎症反应和氧化状态。本研究数据表明，高水平的SCFA对改善肠道完整性、炎症反应和氧化状态有显著作用。因此，通过日粮添加GlyGln改善肠道微生物群有助于改善断奶仔猪受LPS刺激。

本研究证明了在断奶过渡期补充GlyGln可以增强仔猪抵抗LPS刺激的能力。日粮中添加GlyGln改善了由LPS刺激引起的肠道菌群失调，并富集了厌氧菌和产生SCFA的细菌，这有助于改善肠道完整性、炎症反应和氧化状态。这些发现为GlyGln样肽作为一种功能性食品成分的开发提供了新的视角，通过靶向肠道微生物群来调节肠道屏障功能、炎症反应和氧化状态。