编译：艾奥里亚，编辑：木木夕、江舜尧。

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本研究土壤采集自江西省鹰潭市（116° 94′ E, 28° 21′ N），所有土壤样本均采集地上20厘米处新鲜土壤，并对土壤的理化性质进行测定。采集的土壤过2 mm筛，然后充分混合均匀。土壤置于室温（20°C）和恒定湿度（田间持水量的30%）下临时储存（<2周）在定期曝气袋中用于制备土壤悬浊液，其余的用γ射线（>50kGray）照射用于土壤的灭菌。

将250g经γ射线灭菌的土壤放入500 mL的瓶子中，构建无菌的土壤微环境，随后在20°C的黑暗中预培养4周，每隔2天添加一次无菌蒸馏水，以保持45%的田间持水力。在预培养期间，将石灰（CaO）和硫酸亚铁（FeSO₄）与无菌蒸馏水一起加入，以产生4.5、5.5、6.5、7.5和8.5的土壤pH梯度。预培养后，基于平板涂布以及DNA提取，以确认土壤微环境的无菌状态。将20g新鲜土壤放入180 ml无菌蒸馏水中，在搅拌机中搅拌5 min，制成10^-1土壤悬浮液。然后将该10^-1悬浮液连续稀释，分别构建10^-4、10^-7和10^-10的土壤悬浮液。随后，各稀释梯度的悬浮液在接种前充分混合。分别将10^-1、10^-4、10^-7和10^-10的土壤悬浮液接种到每个pH水平的微环境中。每个处理6组重复。未处理的原始土壤作为对照进行培养。综上，我们共建立了126个土壤微环境[（5个pH水平×4个稀释水平+1个原始土壤）×6个重复 ]。所有的土壤微环境都在20°C的黑暗中以45%的田间持水力下培养16周。期间每2周测量一次土壤pH值。在培养期间，每4周从每个土壤微环境中采集两个重复的土壤样本，进行DNA提取，并用于后续分析。

1 稀释处理降低了土壤细菌群落的α多样性和稳定性

在基于分类学丰度的加权UniFrac下，不同稀释水平土壤中细菌群落和未稀释的初始土壤之间群落差异随稀释程度的增加而显著增大。然而，10^-1稀释倍数下的土壤样品与未稀释的初始土壤样品之间未表现出显著差异。考虑到没有对未稀释的初始土壤样品进行pH调节，也没有发现其与10^-1稀释倍数下菌群落有显著差异，本研究后续仅对稀释和重新构建的土壤细菌群落进行了分析。

稀释对土壤细菌α多样性有显著影响（图1a）。低稀释倍数下的土壤系统发育多样性最高，同时随着稀释倍数的增加，系统发育多样性显着降低（P<0.01）。此外，在不同稀释倍数下，我们发现土壤βNTI值与不同pH处理之间存在显著的正相关关系（R²≥0.35，P< 0.001）。在相同土壤pH条件下，稀释倍数与βNTI之间呈正相关关系（R²=0.59，P< 0.001，图1b）。

平均变异程度（AVD值）随稀释倍数的增加而增加，与样本测序深度无关。为了验证AVD指数作为微生物群稳定性指标的可靠性和应用价值，我们计算了Niu等人研究的不同菌群复合体的菌群AVD值--该研究构建了一个由7个菌种组成的人工合成群落，包括Enterobacter cloacae（Ecl）、Stenotrophomonas maltophilia（Sma）、Ochrobactrumpituitosum （Opi）、Herbaspirillum frisingense（Hfr）、Pseudomonas putida（Ppu）、Curtobacterium pusillum （Cpu）以及Chryseobacteriumindologenes（Cin），并对群落稳定性进行了评价。该研究发现，E. cloacae（Ecl）对维持整个人工构建的合成细菌群落的稳定性至关重要。在本研究中，我们发现，当E. cloacae被从群落中移除时，AVD值最高。这表明AVD适合用来指示微生物群的稳定性。

当这些数据集在每个稀释水平内根据土壤pH进行划分时，近中性pH的土壤AVD值较低。为了评估物种丰富度对细菌群落稳定性的贡献，我们探究了AVD值与细菌物种丰富度之间的关系，通过分析我们发现，AVD值与物种丰富度之间呈负相关关系（R²=0.47，P=0.0009，图1c）。

为了阐明功能基因和微生物群稳定性之间的关系，基于“随机森林”方法我们评估了与AVD值相关的基因类别的重要性。其中，特定代谢功能比例的重要性高于其他功能类别（图1d）。“氮代谢”（平均准确度下降值为0.736）和“磷酸和磷酸酯代谢”（平均准确度下降值为0.749）被视为是最重要的代谢功能类别。因此，整体上特定代谢功能的相对丰度的变化可能会导致平均下降准确值的下降幅度更大。这表明，较低的AVD值与较高的专一化代谢功能相关，其次是广泛的代谢功能、环境信息处理，最后是细胞过程。

图1 重新构建的土壤细菌群落多样性和变异度。a代表细菌系统发育多样性指数在土壤pH和稀释梯度上的差异；b代表βNTI水平与稀释水平之间的关系，△pH代表土壤pH的差异；c代表细菌OTU丰富度与重新构建的细菌群落平均变异程度（AVD）之间的关系；d代表基于随机森林方法分析计算的功能类别的重要性。

2 稀释简化了功能基因共现网络

在不同低水平上，我们基于物种之间很强的相关性或是显著的相关性（r>0.75，P<0.01），采用网络分析的方式探究了功能基因之间的共现模式。随着稀释倍数的递增，菌落之间模块化指数从0.680下降到0.579（表1）。尽管稀释对整体功能基因共现模式具有影响（图2），但每一个稀释水平下的共现网络均可分为两个主要的基因聚集模块。我们将其中一个基因聚集模块定义为“代谢过程”，它主要由编码广泛和专有代谢功能的基因组成。另一个基因聚集模块被定义为“环境信号响应”，该模块主要包含与细胞过程和环境信息处理相关的基因。其余的功能类别、遗传信息处理和有机体系统并不是特定存在于这两个基因集合中的。但在10^-10稀释倍数下的共现网络中，我们仅观察到一个基因模块。

表1 在不同稀释梯度下，功能基因共现网络的拓扑性质及其各自对应大小的随机网络

图2 在不同稀释梯度下功能基因的共现网络。a-d分别代表在10^-1（a），10^-4（b），10^-7（c），10^-10（d）四个稀释梯度下的共现网络。

对于所有的共现网络，经验网络中的平均聚类系数、平均路径距离和模块化指数都大于它们各自对应的随机网络的平均聚类系数、平均路径距离和模块化指数（表1）。稀释处理对土壤群落具有较为强烈的影响，其表现为总节点（功能基因）和总链接数量（正相关或负相关连接数）的减少。随着稀释梯度的增加，土壤微生物群落的平均程度、平均聚类系数、模块度和绘制出来节点的密度指数也随之越低，这一结果说明稀释处理降低了重新构建的土壤微生物群落的复杂性。虽然10^-4稀释倍数下网络中的这些指数也略高于10^-1稀释倍数，但平均路径距离遵循相反的趋势。总的来说，稀释处理降低了基因共现网络的复杂性。

对于基因聚集的模块--“新陈代谢过程”而言，尽管正相关和负相关的数量都随着稀释程度的增加而减少，但我们观察到，在各自的稀释梯度下，其每个梯度下的正相关和负相关的数量几乎相等（表1）。专一性的代谢功能基因在低稀释梯度下的网络中占主导地位，而广泛的代谢功能基因在高稀释梯度下的网络中占主导地位（图2）。此外，在“环境信号响应”的基因集合中，大多数相关联的基因都表现出正相关关系（表1），同时，基因之间关联程度随着稀释梯度的增加逐渐变得不那么复杂。在10^-10的稀释梯度下的网络中并没有观察特有的“代谢过程”和“环境信号响应”的基因聚集模块（图2d）。

3 致力于特定功能的Keystone微生物促进了土壤微生物群的稳定性

根据各个节点在模块内和模块之间的关联程度，我们评估了所有功能类别的拓扑特征，并定义了每个网络内的Keystone功能。在低稀释倍数的网络中（稀释倍数为10^-1和10^-4），专一代谢功能的“氮代谢”和“磷酸和磷酸酯代谢”节点是“代谢过程”基因聚集模块中的keystone功能。而“环境信号响应”基因聚集模块中所对应的keystone节点被识别为细胞过程中的“adherens junction”和环境信息处理中的“ion channels”。相反，在高稀释倍数下的共生网络中（10^-7和10^-10稀释梯度），广泛代谢功能中的“柠檬酸循环”、“糖酵解/糖异生”、“淀粉和蔗糖代谢”以及细胞过程中的“细菌趋化”是其中的keystone 节点。

由于随机森林分类法和功能基因共生网络分析中keystone 节点的识别，我们将“氮代谢”和“磷酸盐和磷酸盐代谢”这两种特殊代谢功能定义为最重要的功能，因此我们进一步进行了分类注释，以确定相关的类群。其中，我们在“氮代谢”中共鉴定出8个属，在“磷酸盐和亚磷酸酸盐代谢”中鉴定到44个属（图3）。所有这些属在低稀释梯度的样品中都较为丰富，同时稀释处理所产生的影响比不同pH处理所产生的影响更高（图3a）。Nitrospira是影响土壤氮代谢的最常见的属，其次是Rhizobacter，Mesorhizobium，Steroidobacter和Burkholderia （图3b）。Gemmatimonadetes中的Gemmatimonas是参与磷酸盐和亚磷酸酸盐代谢中的最丰富的属，随后依次是Solirubrobacter，Brevundimonas以及Rhizomicrobium。相比之下，虽然一些已鉴定的细菌属并没有通过扩增序列检测到，但我们在功能基因注释中发现了一些较为丰富的细菌属，如与土壤氮代谢有关的Nitrospira，Rhizobacter以及 Burkholderia，与磷酸盐和磷酸盐代谢有关的Gemmatimonas和Brevundimonas。

图3 两个keystone功能的分类注释。a代表基于鸟枪法宏基因组数据所鉴定的8个与“氮代谢”相关的细菌属和44个与“磷酸盐和磷酸盐代谢”相关的细菌属在不同土壤pH和稀释梯度下的相对丰度；b代表基于鸟枪法宏基因组数据的相应属的相对丰度。

多年来，在理论生态学领域，生物多样性与生态系统稳定性之间的关系一直存在争议，而目前的相关研究大多通过相互作用模型或仅由少数物种组成的人工构建的简化体系来进行。由于土壤微生物群落的高复杂性、高物种多样性和土壤生态系统本身的棘手程度，在土壤微生物生态系统中解决这一生态学理论的适当实验仍然很少被探索。一般而言，土壤微生物群的特征是功能具有冗余性，而正是由于有些物种并非不可替代的，因此当一些物种适度减少时，其所执行的功能可能会被其他物种所替代，因此任何类群丰度的适度减少都可能会对土壤微生物群的整体功能造成边际效应。然而，严重的多样性丧失将导致生态系统功能受损。

稀释处理降低了接种物中细菌的系统发育多样性。因此，这种多样性的降低应该会对土壤微生物组配过程产生显著的影响。βNTI与稀释梯度和土壤pH差异的关系表明，随着稀释水平或土壤pH差异的增加，土壤微生物群落的组装过程从明显低于预期的系统发生周转率转变为显著高于预期的系统发生周转率。因此，这一结果表明，土壤微生物群落在不同pH水平之间的差异在较高稀释水平下较大。

微生物群落的稳定性可以用群落的恢复力（群落恢复到另一种稳定状态的过程）或抵抗力（群落对干扰的反应保持不变）来表征。因此，可以通过比较不同环境条件（如温度、土壤pH）下微生物群落组成或者是功能的变化来评估微生物群落的稳定性。理论上，如果一个群落足够稳定，在持续的环境扰动下，其组成和功能将不会产生很大的变化。本研究中，基于实验设计，我们通过计算AVD值开发了一种新的研究策略来研究土壤微生物群的稳定性。与其他方法相比，这种策略不受样本数量的限制，在评估群落稳定性方面具有优势。和预期的结果相一致，本研究中，在低稀释梯度的样本中（包含较高的细菌系统发育多样性），低AVD值表现出较低的变异程度。此外，较高的系统发育多样性往往出现在中性pH附近，并与较低的AVD值相对应。因此，较小的变异与微生物群落中较高的微生物系统发育多样性有关，表明土壤微生物群落的稳定性与生物多样性之间存在正相关关系。

网络分析可以全面的了解微生物群之间的相互作用，并在系统发育和功能层面上理清共生模式。不同稀释处理对土壤功能基因共生网络的平均程度、平均路径距离和模块性具有显著影响。在稀释度越高的网络中，平均程度、图中节点的密度和平均聚类系数值越低，而平均路径距离越大，说明主要功能节点之间的耦合性降低。与10^-1稀释梯度下的网络相比，10^-4稀释梯度下网络的独特之处在于其总节点数较少，但平均度、图形密度和平均聚类系数略高。这表明，尽管微生物多样性下降，但适度的多样性丧失可能会提高土壤微生物群的代谢效率。由于较高的模块化有助于增加网络的稳定性和促进微生物组的稳定性，因此，低模块化的土壤微生物群落表明其所具有的不稳定性。

已有的研究表明，稀释同时降低了专有化和广泛功能的功能多样性，其中专有化代谢功能基因的相对丰度降低，而宽广泛代谢功能基因的相对丰度增加。本研究中，我们观察到了专有化和广泛化的代谢功能基因之间大多表现出负相关关系，这恰恰可以用一系列稀释所导致的这两类基因的相对丰度呈相反的趋势变化所解释。广泛的代谢功能通常与可以在单个细胞内完成的细胞内代谢有关。然而，专有的代谢功能可能涉及一系列功能或分类上特定的微生物物种的多个步骤。因此，稀释处理降低了微生物多样性，减少了特殊代谢功能基因的出现，而这一结果似乎对生态系统的多功能性和微生物群的稳定性产生了负面影响。

基于不同的分类方法，通过对宏基因组数据的分析，我们发现，在土壤微生物生态学中广泛使用的随机森林分类法在确定所有功能类别的重要性方面最为准确。此外，网络中高连接性的微生物类群通常是共现网络中的keystone成员。有趣的是，随机森林分类和功能基因共现网络分析都表明，“氮代谢”和“磷酸酯和磷酸酯代谢”是与AVD值相关的keystone功能，可能有助于微生物群的稳定性。

对“氮代谢”和“磷酸盐和磷酸盐代谢”作为keystone功能的分类学诠释表明，一系列细菌属可能是与微生物群稳定性有关的keystone物种。这些细菌主要分属于Actinobacteria和Proteobacteria细菌门中，这与之前的研究相一致。“氮代谢”相关功能在本研究中被视为是一个Keystone功能，其中包含了诸多包含Nitrospira，Rhizobacter，Mesorhizobium，Steroidobacter以及Burkholderia等在内的潜在的Keystone属。其中Nitrospira是氨氧化菌和亚硝酸氧化菌，而Rhizobacter、Mesorhizobium和Burkholderia属于固氮菌。此外，Steroidobacter与反硝化过程有关。除了本研究之外，在不同的生态系统中的诸多研究表明，氮循环类群一直被认为是keystone类群。相比之下，“磷酸盐和磷酸盐新陈代谢”的功能还没有得到很好的证明。然而，丰度最高的Gemmatimonas属是农业生态系统中的优势类群之一。其他细菌属如Solirubrobacter、Brevundimonas和Rhizommicrobium也已被确定为Keystone分类群，这其中的许多的微生物类群含有与土壤有机碳周转有关的广泛代谢功能，但目前并没有证据表明这些Keystone分类群具有特殊的代谢功能。

有人提出，Keystone分类群的重要性可能与一个过程的广度有关，其所指代的是涉及到多少个代谢步骤或是涉及到多少不同的微生物群。在本研究中，稀释处理降低了细菌的总体系统发育多样性和Keystone功能和类群的相对丰度。这伴随着共生网络复杂性的逐渐降低和微生物群稳定性的降低。已有的研究虽然表明土壤微生物多样性的下降不会影响土壤关键微生物功能群的稳定性，但在该研究中，一方面由于功能类群的分布较为宽泛，另一方面由于稀释梯度没有足够的明显，以至于土壤功能的冗余可能不会被完全抵消，这导致了我们在研究结果上的不一致性。但基于我们的研究，我们推测，Nitrospira、Rhizobacter和Burkholderia等丰富的细菌属代表着“氮代谢”的keystone功能类群，而Gemmatmonas和Brevundimonas等细菌属代表着“磷酸盐和磷酸盐代谢”的keystone功能类群，它们可能是影响土壤微生物群落稳定性的关键类群。

综上所述，稀释处理显著降低了系统发育多样性，简化了功能基因共生网络的模块性，降低了土壤微生物群落的稳定性。我们强调了“氮代谢”和“磷酸盐和磷酸酸盐代谢”的特殊代谢功能与土壤微生物群的稳定性有关，这些代谢功能与土壤微生物群落的稳定性密切相关，这些代谢功能主要集中在Nitrospira和Gemmatimonas等丰富的特定细菌关键类群上。这些Keystone功能和分类群可能为微生物群落迁移的预测提供进一步的洞察力，并增加调控微生物组功能的可能性。进而可以利用这些Keystone分类群对微生物群稳定性的可能贡献来改善生态系统服务。

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