编译：微科盟HushKuo，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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1 真菌感染会提高昆虫ecdysone (20E)的水平，导致免疫介导的抗菌素基因表达上调

研究发现，与对照幼虫相比，两种昆虫寄主中的B. bassiana或M. anisopliae均在感染过程中致使20E水平显著增加（P < 0.01）。B. bassiana或M. anisopliae感染G. mellonella幼虫会导致20E水平升高，接种后72 h达到对照的2倍至3倍。相似地，两种真菌在侵染S. litura幼虫时20E水平随侵染时程升高。相比之下，M. rileyi感染导致20E浓度的升高显著于B. bassiana或M. anisopliae。20E浓度均显著低于对照组（P < 0.01, 图1.A, B）。Beauveria bassiana诱导了GmCec和GmGlo的最大表达，而M. anisopliae诱导了GmGal、GmGst和GmPGRP-B的表达。除GmGal、GmGlo和GmPGRP-A以及GmPGRP-B的某些时间点外，M. rileyi感染的大多数情况下，所检测的大多数基因的表达均低于其他真菌，和/或与对照相比相当或更低。对S. litura而言，相似的免疫相关基因（SlGal、SlGlo、SlCec、SlLectin、Moricin、SlMor、SlAtt）显示出与G. mellonella中相似的趋势。与B. bassiana和M. anisopliae相比，M. rileyi侵染的幼虫中大多数基因的表达更低。

直接测试20E对免疫响应基因表达和真菌毒力的影响的实验发现，注射20E诱导了G. mellonella所检测基因的表达，20E与B. bassiana分生孢子的共注射在大多数情况下没有显著增强这种作用。然而，与单独的B. bassiana相比，共注射显著提高了宿主存活率，从而使半致死时间（LT₅₀）发生50小时左右变化。

图1. 真菌感染后ecdysone水平升高。真菌感染对ecdysone浓度影响的时程：（A）第五代G. mellonella的局部注射。（B）第四代S. litura幼虫的血腔内部注射。（C） G. mellonella幼虫经血腔注射灭活真菌（M.rileyi-I和B. bassiana-I）和细胞壁成分（壳聚糖，β-葡聚糖和肽聚糖（PGN））后的ecdysone水平。

图2. 真菌感染使ecdysone水平升高诱导的免疫相关基因上调。B. bassiana、M. anisopliae和M. rileyi侵染后G. mellonella幼虫中免疫相关基因表达的qPCR时程分析。检测的基因包括：天蚕素 (GmCec)、Gallerimycin (GmGal)、Gloverin (GmGlo)、谷胱甘肽S-转移酶 (GmGST)及肽聚糖识别蛋白AB (GmPGRP-A,B). GmActin基因用作标准化的参考基因。

2 MrE22O在真菌感染期间使宿主20E失活

野生型M. rileyi、MrE22O^OE和Bb::MrE22^OE对20E具有氧化作用，但并非由衍生自ΔMrE22O突变体或野生型B. bassiana的提取物进行转化。MrE22O的体内效应实验表明，真菌接种后，ΔMrE22O菌株未能抑制20E诱导。由于肠道微生物组会影响20E水平，使用饲喂抗生素头孢菌素的昆虫进行了相同的实验，结果与标准饲喂的昆虫显示相同特征。

3 缺少MrE22O的Metarhizium rileyi不能抑制宿主免疫相关基因的诱导并显示出削弱的真菌毒力

宿主基因对M. rileyi野生型菌株和MrE22O^OE菌株的响应均相似，但SlMor除外，其在MrE22O^OE菌株中的表达明显较低（P < 0.01）。无论是给昆虫喂标准饲料还是含有头孢菌素的饲料，在宿主基因表达的总体特征上均未见明显差异。研究发现，与对照相比，感染M. rileyi菌株会引起PO活性的增加。但与没有MrE22O的菌株相比，MrE22O的缺失导致注射后36小时PO活性降低约20％，注射后60小时未观察到显著差异。ΔMrE22O突变体在局部和注射实验中均显示LT₅₀升高（毒力降低）。野生型M. rileyi与MrE22O^OE菌株相比，局部实验中MrE22O的缺失使LT₅₀显著升高12.4%。血腔内部注射实验显示，亲本菌株与过度表达型菌株相比，LT₅₀升高14%-22%。

图3. MrE22O的缺失增加20E和宿主免疫基因表达，并降低毒力。（A）指示真菌菌株感染的S. litura幼虫中的ecdysone浓度。（B）感染后144小时指示S. litura免疫反应的基因表达分析。SlActin作为参考基因，检测的基因包括：天蚕抗菌肽（SlAtt），杀菌肽（SlCec），Gallerimycin（SlGal），Gloverin（SlGlo），Moricin（SlMor）。（C）血腔内部注射的昆虫生物实验。（D）使用局部注射方案的昆虫生物实验。*表示P <0.05，**表示P < 0.01，ns表示t检验不显著。

4 MrE22O对真菌感染过程中宿主生长发育的影响

在用M. rileyi、MrE22O缺失突变体和/或MrE22O过表达菌株处理的S. litura中，蜕皮和化蛹方面没有观察到明显差异。但将分生孢子添加到S. litura的食物中后，15天内经测定中发现化蛹率存在显著差异。在该实验中，野生型M. rileyi菌株的感染导致感染后12天的化蛹率达到20％，在感染后15天逐渐增加至40％，略低于未处理的对照（图4A）。但是，用ΔMrE22O菌株处理可显著提高化蛹率，感染后10-12天可达到40％-60％，处理后15天可高达70％。MrE22O^OE菌株进行处理最初抑制化蛹，在感染后10–12天仅有5％–10％的化蛹，然后在处理后15天逐渐达到40％的化蛹。处理后15天存活幼虫、进入正常化蛹的幼虫、未成功化蛹的幼虫及死亡的幼虫的百分比变化如图4B所示。

图4. MrE22O对宿主发育的影响.（A）Spodopteralitura幼虫（二代）通过口服喂食（5×10⁴分生孢子/幼虫）处理，分生孢子源于野生型M.rileyi、ΔMrE22O和MrE22O组成型表达（MrE22O^OE）菌株，昆虫蛹期开始计数.（B）处理后15天存活幼虫、进入正常化蛹的幼虫、未成功化蛹的幼虫及死亡的幼虫的百分比。

5 Metarhizium rileyi MrE22O改变肠道细菌微生物组的数量

宿主死亡3天后的尸检显示，与野生型和MrE22O^OE菌株相比，ΔMrE22O菌株对死虫表面的定殖更快，而在饲喂含有抗生素（头孢菌素）的昆虫中则无定殖情况。由MrE22O调控的20E水平会导致肠道细菌微生物组的数量差异。CFU计数和细菌RT-PCR定量数据均表明，M. rileyi野生型或MrE22O菌株的感染增加了细菌载量，而ΔMrE22O感染却使昆虫的总体细菌载量降低。与ΔMrE22O菌株相比，感染野生型M. rileyi和MrE22O^OE菌株的幼虫的菌丝体生长明显降低，尸体分生孢子产量降低，死后6天降低了25％–85％。喂食昆虫细菌抗生素可以改善这种效果，与喂食标准食物相比，喂食抗生素的幼虫尸体上分生孢子产率高31％–65％。为了进一步确定MrE22O的作用，为了进一步证实MrE22O的作用，从异源酵母表达系统Pichia pastoris表达并纯化了该蛋白。纯化的蛋白质，通过HPLC验证了E22O活性。与对照相比，注射纯化的MrE22O到S. litura幼虫12h后20E浓度显著降低（57％，P < 0.01）。此外，在经过MrE22O处理的幼虫（12小时）中，与对照组相比，一组免疫相关基因的表达降低了10％–60％（注射后12和18小时），总细菌载量增加了150％（P < 0.01）。此外，与单独注射ΔMrE22O相比，将纯化的MrE22O与源自MrE22O缺失菌株的分生孢子共同注射降低了免疫相关基因的表达，将毒力表型恢复为野生型菌株的毒力表型。

图5. MrE22O的缺失导致宿主肠道微生物组的改变和宿主尸体上真菌的生长。（A）死后3天，尸体上真菌外生的代表性图像。（B）M. rileyi、ΔMrE22O和MrE22O组成型表达（MrE22O^OE）菌株处理120和144h后S. litura肠道细菌总数的16S核糖体DNA定量分析。（C）M. rileyi、ΔMrE22O和MrE22O组成型表达（MrE22O^OE）菌株致死的S. litura尸体上分生孢子的定量分析。（D）感染后120 h，指示真菌菌株感染的幼虫宿主肠道总细菌集落形成单位（CFUs）。

6 B. bassiana中MrE22O的表达导致菌株能够降低宿主20E的浓度并抑制宿主免疫相关基因的表达，从而导致真菌毒力的总体增加

为了分析B. bassiana中MrE22O的表达对宿主20E水平的影响，将Bb::MrE22O-8菌株用于以G. mellonella幼虫为宿主的局部感染。定量分析了野生型B. bassiana和Bb::MrE22O-8侵染G. mellonella中的ecdysone水平发现，相比于野生型亲本，表达Bb::MrE22O-8的菌株在整个感染过程中使ecdysone水平降低（25％–50％）。与野生型相比，包括GmPGRP-A、GmPGRP-B、GmGlo、GmGal、GmFer、GmGST和GmCec在内的一套与G. mellonella免疫相关基因的表达均显示出降低趋势（GmGST除外）。昆虫生物实验结果显示，MrE22O在B. bassiana中的显著表达（P < 0.01）提高了真菌毒力以对抗G. mellonella幼虫，宿主的半数致死时间（LT₅₀）和杀死宿主所需的半数致死浓度（LC₅₀）降低。与野生型菌株相比，Bb::MrE22O-8的LT₅₀相对于G. mellonella降低了30％（即更具毒性）。接种后5天， Bb::MrE22O-8菌株的平均致死浓度也降低了12倍，LC₅₀取值为（17.3±3.0）×10⁶分生孢子/ ml（Bb::MrE22O-8）到（1.45±0.23）×10⁶（野生型亲本）之间。正如在表达MrE22O的M. rileyi菌株中观察到的，MrE22O在B. bassiana中的表达还引起被感染G. mellonella中细菌载量的增加和尸体上真菌生长的延迟。

图6. B. bassiana中MrE22O的表达对宿主的影响。MrE22O表达B. bassiana侵染的G. mellonella幼虫中ecdysone浓度及宿主基因表达分析。野生型B. bassiana菌株（WT）及MrE22O表达型B.bassiana菌株通过局部注射侵染G. mellonella幼虫。（A）宿主血淋巴中的20E浓度。（B-H）基于总RNA提取的GmPGRP-A, B、GmGlo、GmGal、GmFer、GmGST、GmCec基因的RT-PCR分析。*表示P <0.05，**表示P < 0.01，ns表示t检验不显著。

图7. B. bassiana中MrE22O的表达增加了真菌毒力，但减少了尸体上真菌的生长。（A）B. bassiana和Bb-MrE22O^OE的昆虫生物实验分析（G. mellonella幼虫作为宿主）。（B）B. bassiana菌株感染96h后G. mellonella幼虫宿主中的总细菌数分析。（C）头孢菌素抑制G. mellonella幼虫的肠道菌群生长。（D）死后4天尸体上真菌生长的代表性图像。

昆虫激素（JH和蜕皮甾类激素20-hydroxy-ecdysone (20E)等）在调节昆虫各种生理过程（包括昆虫的发育，生长，繁殖，衰老和免疫力）中起着重要作用。我们的研究表明，昆虫利用20E作为信号分子来上调免疫相关基因的表达来响应真菌的感染，M. rileyi产生MrE22O转化20E使其失活。M. rileyi的体外蜕皮甾类激素失活活性已被报道，然而该酶的生物学作用和产生的后果尚未鉴定。MrE22O可以抑制昆虫的防御反应，增强真菌的毒性。MrE22O的存在促进感染的宿主免疫抑制的效果使宿主微生物组发生变化，同时也最终改变了病原体。宿主免疫系统受到抑制，肠道细菌微生物组发生变化，可能导致真菌在尸体上定殖和形成孢子的能力/速率降低，进一步证实了尸体上的生长是寄生生命周期的重要且离散的阶段，有助于昆虫病原真菌的适应性。由于孢子形成被认为是整体适应性的关键因素，因此孢子减产会带来很大的不利影响。MrE22O在感染初期赋予了益处，但在尸体上分生孢子的生产期间产生不利影响。这有助于解释为什么E22O基因在昆虫致病性真菌中分布不广泛。

尽管昆虫似乎使用20E作为信号分子来诱导免疫相关基因的表达，但在昆虫病原真菌中，靶向20E似乎是一种受限制的现象，即缺少E22O基因不会使B. bassiana成为比M. rileyi更弱的病原体。然而M. rileyi MrE22O在B. bassiana中的变异表达抑制20E水平，进而降低了宿主防御性免疫相关途径的激活，最终提高了转基因菌株的毒力。权衡是显而易见的，并且与野生型亲本菌株相比，表达MrE22O的B. bassiana菌株在宿主尸体上的分生孢子减少。因此，需要进一步使M. rileyi具有更明显的生态学优势，这可能与寄主的范围和可用性，以及环境因素和/或与其他微生物的竞争有关。

尽管（致病性）真菌诱导20E水平升高的途径尚待确定，但数据显示灭活真菌细胞以及细胞壁成分能够诱导增加的20E水平，因此该过程可能是由模式识别受体介导的。从B. bassiana异源表达的结果可以看出，MrE22O基因在提高昆虫病原性真菌效力方面具有潜在应用性，从而增加可用于改善昆虫病原性真菌毒性的策略。另外，通过靶向关键宿主激素，可以降低目标宿主对生物防治剂产生抗药性的可能性。

总而言之，该研究表明，M. rileyi在表达靶向宿主ecdysone激素失活酶方面已进化出一种特定的适应性。赋予病原体优势的机制之一可能是通过阻断ecdysone对先天免疫途径的激活。然而，通过干扰正常的免疫功能，会引发宿主微生物组的改变，从而导致宿主尸体上的分生减少。因此，MrE22O基因是拮抗多效性的示例，在真菌（致病性）生命周期的早期提供益处，在后期阶段致害。

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