博文
AlphaFold-Cluster的五回合论战
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AF-Cluster发表于2023.11的Nature，以蛋白质计算领域的发展速度来衡量，已经是老文章了。自其发表以来，正反两方科学家进行了多轮攻辩，过程涉及2篇Nature、1篇Nat Comms、1篇J Mol Biol，以及6篇预印本，互相“中门对狙”，并在2025.8暂告一段落，可谓精彩。更重要的是，这一系列工作所讨论的问题——AlphaFold2/3 预测具有多构象的蛋白质的结构，是AlphaFold的重要议题之一。
下面，我们简单地回顾这场多回合论战：
第一回合：正方，AF-Cluster
第二回合：反方，单序列就够了
第三回合：反方，AlphaFold2是大记忆恢复术
第四回合：反方，随机采样更好
第五回合：正方，你全错
正方：
Hannah K. Wayment-Steele (Scripps & HHMI, UW Madison), Sergey Ovchinnikov (MIT), Lucy Colwell (Google & Cambridge), Dorothee Kern (Scripps & HHMI)
P1. Wayment-Steele, 2023.11, Nature, Predicting multiple conformations via sequence clustering and AlphaFold2.
P2-1. Wayment-Steele, 2024.7, bioRxiv, A resource for comparing AF-Cluster and other AlphaFold2 sampling methods.
P2-2. Wayment-Steele, 2025.3, bioRxiv, Sequence clustering enhances AlphaFold2.
P2-3. Wayment-Steele, 2025.7, bioRxiv, Does Sequence Clustering Confound AlphaFold2?
P2-4. Wayment-Steele, 2025.8, JMB, Does Sequence Clustering Confound AlphaFold2?
其中P1就是AF-Cluster论文，P2-1, 2, 3是P2-4的三个版本的预印本。
正方相关文献：
P3. Wayment-Steele,2024.10, PNAS, The conformational landscape of fold-switcher KaiB is tuned to the circadian rhythm timescale.
谢尔盖（Sergey Ovchinnikov）是诺奖得主 David Baker的博士学生，2017年博士毕业，若非因为他，我大概率不会特别关注这场辩论并细读这些论文。
反方：
Lauren L. Porter课题组（NIH），包括Devlina Chakaravarty、Joseph W. Schafer等。
N1. Chakaravarty, 2023.11, bioRxiv, ColabFold predicts alternative protein structures from single sequences, coevolution unnecessary for AF-cluster.
N2-1. Chakaravarty, 2023.12, bioRxiv, AlphaFold2 has more to learn about protein energy landscape.
N2-2. Chakaravarty, 2024.8, Nat Comms, AlphaFold predictions of fold-switched conformations are driven by structure memorization.
N3-1. Schafer, 2024.1, bioRxiv, Sequence clustering confounds AlphaFold2.
N3-2. Schafer, 2025.2, Nature, Sequence clustering confounds AlphaFold2.
其中N2-1、N3-1分别是N2-2、N3-2的预印本。
反方相关文献：
N4. Schafer, 2023.9, Nat Comms, Evolutionary selection of proteins with two folds.
为了方便起见，本文仅用上述所有文章所提及的KaiB蛋白作为案例来讨论，而不涉及论文中的其它蛋白，除非必要。
第一回合：正方，AF-ClusterWayment-Steele等人在2023.11.13发表了AF-Cluster。
作者研究变构蛋白（metamorphic protein）KaiB家族的预测结构的进化分布。KaiB家族的蛋白质存在两种稳定的实验晶体结构——基态（ground state）和折叠转换态（fold-switched state, FS）。KaiB蛋白仅有108个残基，其C端部分会发生涉及约40个残基二级结构的构象变化，从而在经典的硫氧还蛋白样结构与独特的替代构象之间切换（P1论文图1a，b）。
作者观察到，通过序列相似性而对KaiB家族的蛋白质序列进行聚类，能使AlphaFold2以高置信度对已知变构蛋白的多种状态进行采样（P1论文图1d）。例如，使用全部KaiB家族的蛋白质序列，搜索并构建MSA后，用ColabFold默认设置进行预测，获得FS态（P1论文图1c左）；然而，如果在序列聚类中，挑选与已知基态结构的序列最接近的序列来搜索并构建MSA，而后预测，则获得基态（P1论文图1c右）。
因此，作者假设：如果一个蛋白家族在进化中形成了偏好不同构象的亚群，那么这些亚群的序列中应包含指向特定结构的“进化耦合（evolutionary coupling. EC）信号”；所以，不必添加任何先验知识，只要能解耦局部序列的EC信号，就能引导AF2预测出不同的构象。
作者将这种简单的MSA采样方法名为AF-Cluster。在AF-Cluster产生的结构分布中，置信度最高的区域恰好对应实验已知的两种状态（P1论文图1e，f）。
P1论文图1。
真正的亮点在于实验验证：作者预测了一个未经充分研究的KaiB变体（KaiBTV-4）应稳定在FS态，并通过NMR实验证实了这一预测（P1论文图2d，f）。更令人印象深刻的是，作者通过比较偏好不同状态的序列聚类，设计出仅三个突变就成功将KaiBRS从基态翻转至FS态（KaiBRS-3m），实验证实突变体群体的FS构象比例从野生型的11%大幅提升至86%（P1论文图3）。
这里要明确：AF-Cluster指代整个pipeline——给定序列，使用ColabFold内置的MMseqs2搜索UniRef30生成该序列的MSA，去除含超过25%空位的序列，再采用DBSCAN算法，对MSA内的序列进行聚类，而后对每个聚类，仅使用该聚类所含的序列（即原MSA的一个子集）用AF2预测结构；如此，获得一个结构系综。
第二回合：反方，单序列就够了在P1见刊仅仅1周后，Porter团队在2023.11.21预印了N1，直白地说，AF-Cluster错了——进化耦合不是必需的，将单序列喂给ColabFold一样能预测出同样的结果（N1论文图1）。
N1论文图1。C端变构区域的残基，使用AF-Cluster预测的着粉色，使用单序列预测的着紫色。
这篇预印非常短（因为只隔了一周嘛），不是一篇完整的研究论文（因此至今停留在预印状态）。
作者使用AF-Cluster预测KaiB蛋白结构，对比仅仅使用单序列（不搜索构建MSA，当然也没有AF-Cluster式的MSA分组采样）的预测结构，发现二者几乎一样，并在观察MSA Transformer产生的接触图后认为不存在进化耦合信号。
第三回合：反方，AlphaFold2是大记忆恢复术仅仅3周后，Porter团队在2023.12.12预印了N2-1，并最终在2024.8.24见刊于Nat Comms，即N2-2。
如果我们是Porter团队，由N1所展示的初步结果，很自然地会引申：既然使用单序列能够预测出和AF-Cluster（使用不同深度的分组后的MSA）一样的结果，那么，针对构象转换（fold-switched）蛋白，AF本质上是否只是一个记忆模型？或者等同地问，AF有没有学习到蛋白质物理（protein energetics）？
N2-2就是为了回答这个问题。
如果AF真正掌握了蛋白质物理，它就应该能够持续且精确地预测折叠转换蛋白的所有实验观测构象；若其无法做到这一点，则意味着某些基于AF的预测很可能主要依赖模式识别——记忆。
为此，Porter团队扩大考察对象的范围，收集了92个经过实验验证的折叠转换蛋白——这是当时最全的经过实验验证的折叠转换蛋白数据集，对AF-Cluster、AlphaFold2/3及其他采样方法进行了大规模基准测试，颇令读者有“宜将剩勇追穷寇”之感。我相信这类“一网打尽”式的基准测试也颇能获得杂志编辑的好感。
Porter团队测试了多个AF模型，包括AF 2.2.0，AF 2.3.1，AFM，AF3等，以及3种“增强MSA采样”的方法——SPEACH_AF、AF-Cluster、ACE。ACE是Porter团队在N4中开发的，全名为“alternative contact enhancement”。结果显示：ALL_AF2的成功率仅为35%（32/92），而AF-Cluster更差——只预测对了18/92组折叠转换蛋白的结构（N2-2论文图1a）。
N2-2论文图1a。图中ALL_AF根据N2-2的图片描述，应当为ALL_AF2，指结合了所有AF2模型的结果。
AF-Cluster的表现劣于ALL_AF2让Porter团队认为P1论文的核心结论是错的。否则，如果AF-Cluster真地通过序列聚类而揭示出编码在进化信息中的构象偏好，那么AF-Cluster应当始终优于AF2。在多样化的基准测试中，仅约20%的成功率只能证明AF-Cluster在P1论文中的成功是一种特定场景的偶然现象，而非可推广的普适原理。
第二，Porter团队展示了两个例子，证明AF2.3.1，AF3，AF-Cluster不能正确预测其训练集之外的折叠转换蛋白的结构。这两个例子分别是Sa1和BCCIP。Sa1是一个人工设计蛋白，存在α/β- plait和3αhelix两种实验结构；BCCIPα和BCCIPβ是两种人蛋白质异形体（isoform），二者序列一致性为80%。AF2.3.1，AF3，AF-Cluster不能预测出Sa1的3αhelix构象，及BCCIPα构象。
N2-2论文图3。
考虑到测试集所包含的92组蛋白都在AF2训练集的截止日期之前被上传到PDB，因此很可能被包含在AF2的训练集之中，作者认为，AF的预测依赖记忆。
第三，Porter团队通过直接控制Evoformer的输入而检查AF2的输出，分3步：（1）将MSA输入AF2，但不进行recycling，预测出构象1，这种情况下，AF2的预测结构仅由Evoformer控制，而Evoformer是对进化耦合信息的解读；（2）将MSA输入AF2，进行recycling（即完整AF2管线），预测出构象2；（3）将MSA输入AF2，进行recycling，并在每一轮recycling之后提取Structure Module输出的MSA，将之作为输入饲喂给没有recycling的AF2（如同1），这种情况下每次都预测出构象1。
这个结论非常有意思，特别是（3）！因为（2）的结论，我们知道最后一次循环后Structure Module输出的MSA会被推理为构象2；那么，我们很自然地会认为，每一次循环后，Structure Module输出的MSA会逐渐接近最后一轮的MSA，进而用每一轮循环后的MSA进行推理应该会获得一个由构象1向构象2转换的轨迹 —— AF2论文展示了类似的轨迹。
但是，（3）却显示，至少对Porter团队所考察的折叠转换蛋白（RfaH）而言，这条轨迹其实是一个阶跃函数，直至最后一轮循环，前面所有的取值都是构象1，然后猛地跃迁到构象2。
并且，（1）-（3）综合表明，对折叠转换蛋白RfaH而言，Evoformer从MSA中解读的进化耦合信号唯一地支持构象1，但是完整的AF2管线却强制性地推理出构象2，所以在AF2预测结构中起决定性作用的不是进化耦合信号，而是从训练集中记忆到的模板结构（通过结构模块而体现）。
第四，Porter团队再次利用单序列（而非MSA）进行预测来证明AF2是记忆模型。已知折叠转换蛋白RfaH的实验结构中的C端结构域（CTD）呈现螺旋束，而CTD序列片段的实验结构呈现β折叠。作者只用RfaH序列的CTD部分作为单序列输入，不搜索MSA，也不进行recycling，AF2唯一地预测出螺旋束。作者认为，出现这种结果的原因是AF2在训练中学习、记忆到了由完整RfaH结构所提供的CTD结构模板，而非蛋白质物理。
第四回合：反方，随机采样更好又过了三周，Porter团队在2024.1.5预印了N3-1——剩勇追穷，恐怖如斯，并最终在2025.2.19见刊于Nature，即N3-2。
我们需要指出，N3-2是一篇“matters arising”（对已发表文章的评论或澄清）——应对发表在Nature的P1，不是一篇“research article”，故其篇幅也非常短（其实N3-2可以看做N1的正式见刊版）。
尽管如此，Porter团队在短时间内（从P1见刊到N3-1预印仅7周）提出了一个新方法：CF-Random，使用ColabFold（CF） + 随机采样的浅层MSA预测结构（N3-2论文拓展图2a）。
N3-2论文拓展图2a。
N3-2的核心论点是P1（AF-Cluster）不是如N2-2所发现的使用范围有限（仅在约20%的折叠转换蛋白上成功），而是在根本上错误的，即“AF-Cluster通过分离出MSA的局部进化耦合信号来预测折叠转换”是错的——简直是要逼着P1撤稿，是可忍孰不可忍？
Porter团队给出的论点与其在N1中给出的论点是类似的：如果AF-Cluster真地有效，那么它应该比使用随机采样的浅层MSA（N3-2）/ 单序列（N1）预测结果好。但是，结果显示并非如此：CF-Random的表现稳定地好于AF-Cluster（N3-2论文图1b），并且AF-Cluster所考察的MSA中并没有足以预测稳定出不同折叠状态的独特的进化耦合信号（N3-2论文图2a）。
N3-2论文图1b（上），图2a（下）。
图2a展示了CF-random测试的不同MSA深度下，主导构象（dominant）与替代构象（alternative）各自独有或两者共有的（common）进化耦合概率之和。在所有MSA深度中，替代构象独有的进化耦合概率均微乎其微，表明这些耦合并非驱动替代结构预测的主要因素。蓝色与红色方框分别表示用于预测主导构象和替代构象时所采用的MSA深度范围。每个箱线图包含600个数据点，箱体表示四分位距，中线代表中位数，须线延伸至四分位距的1.5倍范围。横坐标轴的X:Y表示法对应输入ColabFold的--max-seq与--max-extra-seq参数值。
第五回合：正方，你全错终于轮到正方为自己辩护，Wayment-Steele等人在2024.7、2025.3、2025.7接连预印P2-1、2、3，多次更新预印本论文，并最终见刊于JMB，即P2-4。
Porter团队的论文取标题《Sequence clustering confounds AlphaFold2》，Wayment-Steele等人回击论文取标题《Does Sequence Clustering Confound AlphaFold2?》，可谓“中门对狙”，文中Wayment-Steele等人逐一反驳了N1、N2-2、N3-2。
第一，针对N1，Porter团队选择性地呈现数据。N1篇幅很短，结论是一句话：使用单序列，无需搜索MSA，更无需AF-Cluster聚类MSA，就能预测出和AF-Cluster等同的结果。
这个结果其实已经包含在P1论文的补充材料中，即Wayment-Steele等人做了质控，证明在大多数情况下使用单序列或者浅层MSA就足够预测出相应的构象（P1补充材料图1d，即P2-4图1A）。——难绷，虚空打靶……
我们姑且将系统发育树上最接近的10条序列构建的MSA称为“浅层MSA”（shallow MSA），这可以认为是MSA聚类之后每个聚类内最接近的10条序列（如果聚类所含序列不少于10条）。
N1认为，对KaiBTV-4，使用单序列或2条序列（构建深度极浅的MSA）就可以获得匹敌使用浅层MSA做预测的结果。
Wayment-Steele等人在P2-4图1B - E展示这是错误的：（1）使用浅层MSA，所有AF2的5个模型均在1次循环内快速收敛到正确的NMR结构，且置信度很高（P2-4图1B，D上排）；（2）使用单序列，AF2的5个模型中，有4个即使经过多次循环也不能正确预测，仅1个模型（模型5）在7次循环后接近正确结构，但构象不完整且置信度很低（P2-4图1C，D下排）。——那么，如果没有先验知识，从单序列预测的5个模型中，研究者很可能会选择置信度最高但结构错误的模型3（P2-4图1D下排黑色框）。并且，N1论文中实际挑选出用于展示的所谓正确结构是模型4给出的结果（P2-4图1E），是错误的。
因此，N1的结论全错。
P2-4图1。
第二，针对N2-2，Porter团队的基准测试集的选择不恰当。Wayment-Steele等人在P1中强调，AF-Cluster的假设是有条件的：若一个蛋白质家族的进化历程导致了偏好不同状态（构象）的亚群，则聚类分析可揭示这种构象偏好，即MSA clustering reveals evolutionary encoded structural preferences。在不符合此条件的蛋白质上测试该假设，不是有效的验证。
例如，N2-2中，Porter团队展示了2个反例（我们在上面提到过）：人工设计蛋白Sa1，存在α/β- plait和3α helix两种实验结构的BCCIP。AF-Cluster不能正确预测这两例的折叠转换是可预期的。人工设计的Sa1没有自然演化史，你能期待看到进化耦合信号吗？对BCCIP而言，BCCIPα和BCCIPβ的序列，因为可变剪切（alternative splicing）而存在20%完全不同的片段，由BCCIPα序列搜索并构建MSA，这个MSA在BCCIPα序列与BCCIPβ序列不同的区域完全没有覆盖（P2-4图A），这显然也不适用于AF-Cluster的假设。
P2-4图A。
那么，我们可以问：N2-2所使用的包含92组折叠转换蛋白的基准测试集有多少组不符合AF-Cluster的适用范围呢？换句话说，虽然同为“折叠转换”，但具体是因为进化中累计的点突变而导致的，还是因为其它方式？
一个方法在自身理论不适用的地方失败，不能用来证明它在适用领域内的机制是错的。All models are wrong, except some are useful. Porter团队的基准测试没有证明AF-Cluster的假设错误，而是为其划定了适用范围。
从这个角度理解，针对N2-2和N3-2，Porter团队误解了AF-Cluster的研究目标。
Porter团队认为AF-Cluster是一种表现很差的变构蛋白的结构预测器，原因是将AF-Cluster默认为一个通用构象预测器，但是AF-Cluster却不够普适、不够稳健。他们的批判逻辑是：“如果一个方法声称能预测构象，它就必须在所有或大多数已知的构象切换蛋白上有效，且其置信度指标必须可靠，且不能产生假阳性。” 因此，他们设计了大规模的基准测试，统计成功率，并检查其特异性。
然而，P1的研究目标是，找到了一个探索蛋白质进化-构象关系的新角度，将AF-Cluster视为一个假设生成与机制探索工具，而后通过严格的湿实验证明它在某些情况下是真实存在的机制。其核心目标是回答：“在这个蛋白家族的进化历程中，是否存在偏好不同构象的序列亚群？如果存在，这些亚群是否编码了特异的构象信号？” 它的成功标准是：在适用的体系（即自然进化产生的构象切换蛋白）中，能否揭示这种信号，并做出可被实验验证的预测。它提供的不是一个简单的“是/否”答案，而是一个序列-结构偏好性的分布（P1图2a、b、c）。
所以，在这个意义下，反方依然在虚空打靶。
P1图2a、b、c。
第三，针对N2-2、N3-2的技术细节，Porter团队没有采用与AF-Cluster（P1）相同的参数设置。简言之，AF-Cluster使用了更新的参数集（model_1_ptm, model_2_ptm 等），而N2-2、N3-2则混用了更老的参数集（model_1, model_2 等），二者产生的结果有很大差异（P2-4图B2）。因此，Porter团队的对照组运行结果（旧参数）和Wayment-Steele等人的AF-Cluster运行结果（新参数）的pLDDT分数不能有效比较，而pLDDT是N2-2基准测试中衡量“置信度”和“成功”的关键指标。——说实话，这挺难绷的，N2-1求速发表，却没有检查好参数设置。
P2-4图B2。这里蓝色点对应的[17]指N3-1，橘色点对应的[3]指P1。
并且，Porter团队没有采用相同的采样条件来公平比较AF-Cluster和CF-Random。
这体现在采样。AF-Cluster的默认设置是MSA聚类之后，对每个序列聚类，仅使用AF2的5个模型中的1个预测1次——为了计算效率而牺牲采样。另一方面，CF-Random则会使用ColabFold的5个模型分别预测5次（5 models, 5 seeds），而后再取25个预测结果中pLDDT分值最高者为结果。那么，公平的比较显然应当是，或者AF-Cluster也使用5个模型分别预测5次，或者CF-Random也只用1个模型预测1次。
P2-4图3。
P2-4图3的左侧结构图来自N3-2论文图1b，我们在上方展示过，Porter团队意在通过这样的例子显示CF-Random的结果更好（pLDDT = 73.9），AF-Cluster的结果差（pLDDT = 63.8）——分别对应右侧图第1列红点和第2列黑点。然而，如果不计计算效率，令AF-Cluster有相同的采样次数（5个模型，5次预测）并取pLDDT最佳者，则其与CF-Random的结果大大接近（右侧图第3列黄点）。另一方面，如果不仅仅考虑pLDDT最佳者，而是考察所有采样结果，那么尽管CF-Random有更高的最高值，其均值不仅与AF-Cluster结果接近，而且有大得多的方差（右侧图第4列）。
简言之，如果不考虑计算成本，AF-Cluster和CF-Random的预测效果是很接近的，后者并没有如Porter团队所言远好于前者。
第四，针对N3-2，CF-Random不随机！Porter团队之所以取用CF-Random的名字，是因为他们随机采样MSA，构建浅深度的MSA作为ColabFold的输入。但是，P2-4指出，所谓“随机采样”并非随机。相反，CF-Random结合了两种特定的ColabFold设置，每种设置都各自独立地仅预测一种构象状态（P2-4图2A、C、D）。——这太扯了，基本上表明N3-2不应当通过同行评审发表在Nature。
P2-4图2。
最后，针对N1、N2-2、N3-2，Porter团队一再声称AF-Cluster方法成功预测折叠转换状态不是因为进化耦合。
P2-4做出了最有力的反驳：随机打乱MSA，从而彻底消融任何可能存在的进化耦合信号（图P2-4图4A），查看AF2的预测结果。符合预期，AF2的预测结果也是随机的（图P2-4图4B）。
图P2-4图4A、B。
其实，让人很难想到的是，Porter团队居然会让自己的质疑滑向否定进化耦合。大概是他们在N2-2中针对Evoformer和recycling的消融实验（见上述第三回合），让其产生了“AF2是大记忆恢复术因而训练集中的结构模板会取代（override）进化耦合信号”的思想钢印吧。
还有若干细枝末节的反驳，我们限于篇幅不一一描述。
这样我们基本演绎完了五回合论战。我被Wayment-Steele这一方说服了，作为读者的你呢？
总结和思考1、明确研究目标、划定研究范围、区分研究对象是我们开展自己研究的首要步骤，也是我们学习和分析他人工作的首要步骤。
Porter团队针对AF-Cluster论文（P1）开展了极为敏捷的响应式研究（reactive research），在短短2个月时间内接连预印3篇完成度不一的论文，却始终混淆了AF-Cluster的研究目的，虚空打靶，以至于得到有违领域共识的结论——“AF2预测中进化耦合信号会被结构模板取代”。
这让我们不禁感慨，做研究有的时候还是要慢一点，再慢一点。在我还是本科交流学生时，我后来的博导Karl就告诫我，“两个月就能完成的几乎不可能是好的研究”（见《悼念我的导师Karl Freed》）。
另一方面，先构建尽可能全面的、大规模的基准测试集，再逐一测试各种工具方法，是机器学习/深度学习领域的研究范式。但是，如果不就事论事（case by case），细加辨别囊括入测试集的成员是否具备相当的共性，就很容易在测试后得出误导性的结论。针对折叠转换蛋白，我们需要辨别的是，给定一组折叠转换蛋白，它们之间构象转换的原因是什么？而不能如Porter课题组一样，囫囵吞枣，把成因不同的蛋白全部归入同一个基准测试集。
这也是为什么我在之前文章中说，“在学习和研究路径上，扎实的数学基础、物理图像、生化知识是做好基于深度学习的计算生物学的前提，而不是相反——在缺失理化知识时，从深度学习或人工智能出发，走向生物大分子的计算研究。”（见《随谈：我们能通过公众号读论文吗？》）
2、学术界，特指Nature出版社，的发表规范是否有待统一？
P1一篇发表在Nature的精彩的研究性论文，故而反驳P1的“matters arising”论文N3-2也可以发表在Nature。
但是，通过P2-4的逐条反驳，我们已经知道N3-2的方法和结论有着很容易看出来的很大问题——N3-2应该不能通过Nature的同行评审才对。
另一方面，反驳N3-2的论文P2-4，为什么不能再次发表在Nature，甚至不能发表在Nat Comms（如同N2-2），而只能发在JMB（影响因子 = 4.5）？这是否有违公平？这么做最大的问题在于，只读Nature的大同行，可能会因为N3-2而留下P1（AF-Cluster）错误的印象。
这种问题恐怕我们是不能去问Nature编辑的。
本文完。
2026.2.7于深圳
https://blog.sciencenet.cn/blog-3458695-1521498.html
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