aBIOTECH | 周焕斌团队基于Tf1反转录酶开发水稻高效核酸酶介导的衍生引导编辑系统

引导编辑（prime editing，PE）系统作为一项新兴的基因编辑技术，其介导的靶向基因编辑已经广泛应用于包括植物在内的多种生物中。PE系统相较于传统的CRISPR/Cas9工具能够进行更加精准且多样化的基因编辑。研究人员通过对PE蛋白等多个方面进行优化，使得PE系统的编辑效率和应用场景都得到了显著提升和拓展，能够实现有效的碱基精准编辑和小核酸片段操作（定点删除或插入）。然而，现有的PE系统介导的片段插入技术多是通过对内源DNA片段的替换实现的，如何实现无缝且更大长度的DNA插入仍然是一个亟待解决问题。

近日，中国农业科学院植物保护研究所周焕斌团队在aBIOTECH发表了题为“Enhancing the efficiency of nuclease-based prime editing in rice with the Tf1 reverse transcriptase”的研究论文。在本研究中，作者通过密码子优化获得evoTf1V3反转录酶；相较于经典鼠白血病病毒反转录酶（M-MLV），该酶在长片段插入和单碱基替换两类编辑任务中均展现出更高的编辑效率，由此成功构建了一套可高效实现3×FLAG标签原位插入与精准点突变的植物PE工具。

作者首先将反转录酶evoTf1M4与SpCas9核酸酶进行组合得到rPE20a工具，然后通过将evoTf1M4进行不同版本的密码子优化，得到evoTf1M4（V2&V3），并以此构建rPE20a V2&V3（图1A）。在水稻OsCPK3、OsCPK4和OsCPK6内源基因上进行3×FLAG插入实验测试其效率（图1B-1C），比较这三种编辑工具对于3×FLAG原位标签插入效率的高低。结果显示，在48株T₀代植株中，rPE20aV3在三个靶基因上的效率分别为14.6%、10.4%和18.8%（图1C），且在编辑事件中，基因型多为杂合或双等位编辑（图1D），由此得出结论，rEP20V3对于3×FLAG原位标签插入的效率优于前两个版本的rPE20工具。之后作者对编辑样品进行靶位点的TA克隆和Sanger测序，结果表明3×FLAG标签序列在三个基因的靶位点上均准确插入（图1E）。

图1. PE20系列工具编辑效率比较

介于evoTf1M4V3在3×FLAG标签插入中的效率提升，作者将evoTf1、evoTf1M4V3分别与SpCas9（H840A）切口酶进行融合，得到rPE20b、rPE20c工具（图1A）。在OsACCase、OsALS、OsEPSPS和OsGS3四个水稻内源基因上进行点突变效率的测试（图1F-G）。结果显示在T₀代植株中，四个基因靶位点上rPE20c的编辑效率分别为11.1%、22.9%、26.7%和14.6%，且在编辑后代中，多为杂合编辑事件，较少有编辑副产物的出现（图1H）。说明rPE20c工具能进行有效的内源基因点突变改造。

综上所述，该研究通过优化反转录酶Tf1开发了一套高效的水稻引导编辑工具，能有效实现在水稻内源基因中的3×FLAG原位标签插入以及点突变改造。

该研究得到了生物育种国家科技重大专项和中国农业科学院南繁专项项目的资助 。中国农业科学院研究生院博士生马桂根、硕士生徐豪和博士生张素杰为本文的共同第一作者，中国农业科学院植物保护研究所周焕斌研究员为通讯作者，该团队的博士生李雪琪、刘加强、谢佳月也参与了该研究。

引用本文：

Ma G, Xu H, Zhang S, Li X, Liu J, Xie J, et al. Enhancing the efficiency of nuclease-based prime editing in rice with the Tf1 reverse transcriptase. aBIOTECH 2026:100026. https://doi.org/10.1016/j.abiote.2026.100026