王东课题组研究拓宽CRISPR/Cas9介导的大豆基因组编辑范围

CRISPR/Cas9系统已广泛用于包括植物在内的各物种的基因组编辑。CRISPR/Cas酶对DNA的编辑需要识别原间隔子相邻基序(Protospacer adjacent motif，PAM)，目前广泛使用的SpCas9蛋白主要识别NGG PAM序列，这限制了CRISPR/Cas9系统可靶向范围。为突破这一限制，最近，已报道两种工程化的SpCas9变体xCas9和SpCas9-NG可识别松弛的NG PAM（Hu et al. 2018；Nishimasu et al. 2018），在拟南芥、水稻和番茄等植物中，也报道了这两个变体能识别NG PAM，但不同物种之间的编辑效率差异较大(Wang, et al. 2019; Zeng, et al. 2020; Endo, et al. 2019; Hua, et al. 2019; Ren, et al. 2019; Zeng, et al. 2020; Ge, et al. 2019; Niu, et al. 2020)。然而，这些SpCas9变体是否能应用于大豆基因组编辑尚缺乏系统地分析。

近日，南昌大学生命科学学院王东教授课题组在aBIOTECH期刊在线发表了题为“Expanding the range of CRISPR/Cas9-directed genome editing in soybean”（点击题目查看原文）的研究论文，该研究系统分析了大豆中SpCas9及其不同变体xCas9，SpCas9-NG和XNG-Cas9的基因组编辑效率，拓宽了大豆基因组编辑工具的应用范围。

该研究在SpCas9的基础上引入系列氨基酸的突变，构建了大豆xCas9，SpCas9-NG和XNG-Cas9基因编辑系统，在大豆毛状根转化体系中，通过靶向NARK、FEI与miR156a等19个基因的16种PAM序列（包括CGG，AGA，TGA，CGA，GGA，AGC，TGC，CGC，GGC，AGT，TGT，CGT，GGT，GAA，GAT与NAG）的靶位点进行基因编辑。结果发现，相对于传统的SpCas9，xCas9除在NGG PAM外还在KGA(含TGA和GGA)PAM位点有较高的编辑效率。在3个SpCas9变体中，SpCas9-NG可识别最广泛的PAM，能够识别NGD（包含NGG、NGA和NGT）、RGC（包含AGC和GGC）、GAA和GAT-PAM位点。XNG-Cas9在NGG、GAA和AGY（含AGC和AGT）PAM位点具有较强的编辑活性。

利用SpCas9-NG进行大豆基因组编辑

此外，对SpCas9和xCas9进行脱靶分析，发现它们都在GGA PAM位点引起了脱靶编辑，于是构建了两个高保真的Cas9变体，包括eSpCas9和exCas9，发现这两个高保真的Cas9变体提高了GGA PAM位点的靶向特异性且不降低靶向编辑效率。这些发现大大扩展了Cas9介导的大豆基因组编辑的范围。

南昌大学生命科学学院，江西省分子生物学与基因工程重点实验室讲师贺热情博士和硕士研究生张鹏翔为该论文共同第一作者，王东教授为通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金和江西省自然科学基金的资助。
作者简介：

王东，南昌大学生命科学学院教授，博士生导师。主要从事植物非编码RNA等方面的研究。2018年入选江西省“双千计划”创新领军人才青年项目，2019年入选江西省百千万人才工程，担任江西省植物学会、植物生理与植物分子生物学学会常务理事，中国植物生理与植物分子生物学学会理事。在PNAS、Mol Biol Evol、Plant Biotechnol J发表多篇研究论文。