这是一篇2019年发表在the plant journal的文章，文章中所用到的实验逻辑与方法，和实验室常用的非常相似，在上周的一门必修课程的汇报中我选择了该篇文章进行汇报。本人才疏学浅，希望能和大家一起交流。

    这篇文章主要讲的是，作者利用图位克隆分离了基因DLC1，全称是细线期染色体缺陷基因，水稻中DLC1的突变体的雌雄配子体都是不育的，因为减数分裂发生了紊乱。作者发现DLC1的在花粉母细胞（也就是小孢子母细胞）以及绒毡层中高度表达，并且还编码了一个定位于核内的具有转录活性的B类反应调控因子。另外DLC1蛋白还在酵母和植物细胞中和五种组氨酸转磷酸因子互作，作者由此推测在水稻的减数分裂中存在双组分调节系统。总而言之，文章的结果显示DLC1会影响水稻的减数分裂进而影响生育能力，并且揭示了水稻的减数分裂进程中存在双组分调节系统的可能。

    首先介绍一下文章背景。减数分裂是在大多数真核细胞中都高度保守的一个机制，这也充分说明了它的重要性。在减数分裂中，总共只进行了一次DNA的复制但却伴随着两次染色体的分离，由此使得一个生殖母细胞最后产生四个单倍体生殖细胞。在高等植物的遗传发育中，减数分裂的地位是独一无二的。

    减数分裂分为第一次减数分裂和第二次减数分裂，即M1和M2，M1是从一个四倍体开始的，也就是相当于正常体细胞染色体数量的两倍，但最终产物是两个和正常体细胞染色体数量相等的两个两倍体，所以我们常把第一次减数分裂称为“减量分裂”，而减数第二次分裂类似于有丝分裂，是将两个姐妹染色单体分开，最后形成两个同等的单倍体，所以又常被称为“等量分裂”。

    由此可见，第一次减数分裂是遗传生殖的关键。第一次减数分裂又分为前期、中期、后期和末期，前期中又分为细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期，其中细线期中染色体变成可以分辨的丝状个体，像纠缠的细线一样，所以称为“细线期”，它的英文leptotene就是本文中主要阐述基因DLC的L，刚才也说过，DLC全称就是细线期染色体缺陷基因。

    再来介绍一下摘要中提到的双单元调控系统，简称TCS，是生物中广泛存在的一类从刺激到响应的耦合机制，TCS一般有三个组分，分别是组氨酸激酶HK，组氨酸转磷酸蛋白HP，以及反映调控因子RR。它的作用机制一般是HK接收刺激之后自身磷酸化，并把自己放在组氨酸残基上，HP再把它转运到RR的天冬氨酸残基上，由此实现刺激到响应的转化。常常TCS都对植物的生长发育、抗逆功能有作用。

    接下来说一说文章的结论部分。作者首先是获得了一些雌雄配子都不育的突变体材料，由此产生兴趣继续系统性地观察表型。在营养生长期间，突变体和野生型差别不大，但最后的稻谷里面并没有种子。对成熟期的小花进行观察，发现突变体的颖壳非常干瘪，里面的花器官发育都不正常。继续利用I2-KI染色观察花粉细胞的活性，可以看到突变体花粉活性非常低，几乎为0。再通过曙红B染液做透明染色观察成熟胚囊，野生型的胚囊中卵细胞、极核还有反足细胞等都可以清除看到，但突变体的胚囊内部根本无法形成正常的八核结构。

    接下来作者做了图位克隆来定位基因，这就是非常常见的正向遗传学的研究方法。图位克隆把这个基因定位到了一段85kb的区域，再利用pcr发现这个区域有20kb的缺失，这些缺失导致了3个基因的残缺，分别是08480,08490,08500。但是08490大多在茎中表达，与水稻生殖关系不大，所以剔除了它

    作者想要进一步确认突变体的表型究竟是08480还是08500的缺失导致的，由此运用了RNA干扰技术，在野生型中分别沉默了08480和08500的RNA，获得了两种新的材料，分别命名为Ri1和Ri2。对两种新的植株表型观察发现，Ri1的各种表型都和野生型没有显著的差别。但是Ri2的表型有了显著的差异。两张柱状图分别是花粉和胚囊正常率，可以看到Ri2的两个株系都和野生型有显著差异，这张折线图中，纵坐标分别使08500的表达量还有结实率，PSSR就是结实率，横坐标是对照野生型以及Ri2的各个株系，可以看到几乎所有株系中结实率都是相关的。综上所述，导致突变体生殖异常的是08500这个基因，也就是说08500基因就是DLC1。

    为了进一步验证DLC1的基因功能，作者又做了CRISPR，设计了两个靶位点，获得了五个可用的编辑方式，随后获得了5个株系的dlc1突变体。观察突变体的表型，发现和之前的突变体一样，营养生长和野生型没有区别，但小花、花药、花粉活性和胚囊正常成熟率都显著比野生型差很多。这说明这些表型确实与DLC1有关，DLC1在水稻的生殖发育中起到关键作用。

    以上是作者做的突变体花药发育过程观察以及减数分裂前期染色体变化过程观察，这方面我不甚了解就不多做赘述，感兴趣的小伙伴可以自己去看原文。总之结果是发现突变体的小孢子也就是花粉粒的形成包括绒毡层的形成差异很明显，染色体在减数分裂的细线期就开始出现缺陷。

    作者又做了DLC1的表达模式分析，左图是qrt实验的DLC1的表达量，S代表spikelet小穗的长度，可以看到小穗在2-3cm时基因表达量最高，之后就骤降了。右图是做的在花药中的原位杂交，bcde分别是花药的不同发育时期，可以看到基因会在花药成熟期大量表达，尤其是花粉母细胞还有绒毡层。

    之后又做了亚细胞定位，左边是水稻的原生质体右边是烟草叶片表皮细胞，可以看到基因主要是在细胞核内表达的。

    后来作者又发现，DLC1基因编码的是一类反映调控因子，也就是之前说过的这个双单元调控系统TCS中的RR。我们知道RR在TCS中是和HP也就是组氨酸转磷酸蛋白互作的，那么作者就想要去验证DLC1到底会和哪些HP互作。

    在之前的研究中已经发现，水稻内已知的HP有五个，分别是AHP1/2，PHP1/2/3。作者就想通过Y2H也就是酵母双杂交系统来验证DLC1蛋白和这五个蛋白的互作情况。

    酵母双杂交的原理是这样的，基因的转录需要转录激活因子。转录激活因子通常由两个独立的结构域（domain）构成。其中一个是DNA结合域（binding domain, BD）。另一个是转录激活结构域（activating domain, AD）。这两个结构域是可以独立存在的，但是独立存在的AD和BD是不能够转录基因的。所以酵母双杂交就是把AD和BD分开，放在两个不同的蛋白质上。分别构建载体侵染到酵母的感受态细胞中，在酵母中如果这两个蛋白是互作，那么AD和BD很近，可以结合并引导后面的基因转录。所以可以把酵母放在筛选培养基上，可以筛选出阳性酵母。

    这就是作者做的酵母双杂交实验结果。左边的LT指的是筛选培养基中缺少亮氨酸和色氨酸（可以验证载体构建是否成功）。LT下面指的是培养基在缺少亮氨酸和色氨酸以外，还缺少腺嘌呤和组氨酸（可以验证蛋白是否互作）。结果证明DLC1蛋白和这五个HP都是存在互作的。

    为了进一步验证他们之间的互作，作者又进行了BIFC实验，也就是双分子荧光互补实验这个实验的原理是把荧光蛋白拆分成两个不完整的多肽。分别接在两个蛋白上，如果这两个蛋白互作，那么两个荧光蛋白的多肽就会靠的很近。这样就能形成完整的荧光蛋白。那么就能清楚的看到蛋白互作的地方有清晰的荧光，这个实验比起刚才的酵母双杂交来讲，一个非常好的优点就是可视化。

    这是BIFC实验的结果，可以看到每个都有清楚的荧光，也进一步验证了DLC1蛋白与五个HP蛋白存在互作，也就是可以推测DLC1基因确实编码反应了一个编码调控因子，并且形成了一个双单元调控系统。

    文章总结。首先是偶然发现了一个水稻突变体的表型与野生型存在差异。进而运用图位克隆定位到这个基因，后来运用各种方法定位到产生异常表型的08500基因。再通过CRISPR验证了这个基因的功能。随后又做了大量实验验证了他和其他蛋白的互作，从而验证了他是一个反应调控因子。协助完成了减数分裂中可能存在的双单元调控系统。

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2019-DLC1-PJ.pdf