为什么需要“活菌”层面的证据？

肿瘤微生物组（tumor microbiome）已成为免疫治疗响应差异的重要变量。然而，主流研究依赖 16S rRNA 扩增子或宏基因组测序，仅能提供核酸层面的“存在”信号，无法区分活菌、死菌或游离 DNA。对于功能性研究而言，例如细菌代谢产物对 CD8⁺ T 细胞的调控，活菌才是真正的效应单元。

匹兹堡大学 Marlies Meisel 课题组于 2023 年在 STAR Protocols 发表的方法论文系统建立了从小鼠黑色素瘤中分离、培养并鉴定活共生菌的培养组学流程。该工作为其同期 Cell 论文中“瘤内罗伊氏乳杆菌定植并释放 I3A”的核心发现提供了关键的技术支撑。

图1原文可视化摘要。

来源：Phelps et al., STAR Protocols 2023；CC BY-NC-ND 4.0，原图未经修改。

方法学核心框架

1. 培养基策略：覆盖四大优势菌门

选用六种液体/固体培养基组合：CMM、RCL、MRS、BHI+5% 羊血、CHA、TSB、BBE。每种培养基针对不同菌门的营养偏好设计，确保 Bacillota、Bacteroidota、Pseudomonadota 和 Actinomycetota 均有适宜生长条件。

有氧与厌氧（含 10% H₂、10% CO₂、80% N₂）双轨并行培养，兼顾专性厌氧菌与好氧/兼性厌氧菌。

图2扩增液体培养基与对应琼脂平板

（A）扩充液培养液将被按以下方式镀在对应琼脂板上：CMM蛋白液在CMM琼脂上进行蛋白板;RCL汤底铺在RCL琼气上;MRS汤底铺在MRS琼脂上;BHI+5%汤底，分别铺在BHI+5%琼脂、CHA琼脂、TSB琼脂和BBE琼气上。指出每种汤和琼脂组合所支持的细菌门类及其独特性质。

2. 无菌取材与宿主细胞裂解

小鼠经 70% 乙醇表面消毒，皮下肿瘤剥离时避免接触毛发。

肿瘤组织置于 40 μm 滤网上研磨，随即用 0.05% NP-40 裂解宿主细胞，释放胞内菌。

差速离心（300 × g 去除碎片，8000 × g 富集细菌）收集细菌沉淀。

图3皮下植入小鼠黑色素瘤的无菌切除术

（A） 用70%乙醇彻底湿润安乐死的老鼠。

（B）在肿瘤上方1–2厘米处，在皮肤上切开一个单一切口。

（C）拉开皮肤足够远，露出肿瘤。按住皮肤和后腿。

（D）无菌切除所有肿瘤。

3. 两步扩增法：肉汤富集 + 琼脂平板分离

细菌沉淀重悬后接种至肉汤，37°C 有氧 2 天 / 厌氧 3 天。

将浑浊肉汤划线至对应琼脂平板，继续培养至单菌落出现。

挑取单克隆，PCR扩增16SrRNA全长（27F/1492R），Sanger 测序后经 NCBI BLAST 比对鉴定（≥98% 相似度定种，≥95% 定属）。

图4群落选择管的制备

（A）收集一个250微升移液器尖端。

（B）剪断移液器尖端的宽端，使其尖端能嵌入封闭的1.5毫升翻盖管内。

（C）将缩短的移液器尖端放入事先高压灭菌的1.5毫升管中。

（D）闭管并以121°C、15 Psi高压灭菌20分钟。

4. 污染控制体系

设置两类阴性对照：

肉汤空白对照：直接取培养基进行相同培养流程。

Mock 样本对照：用无菌 PBS 替代肿瘤匀浆，模拟全部操作步骤。

判读原则：仅在实验组中出现且所有对照均阴性的菌落才视为“瘤内真实活菌”。若某菌株在对照中出现，则整批次实验组中该菌株全部剔除。

关键结果与数据质量

成功从小鼠 B16-F10 黑色素瘤中分离出多个活菌株，涵盖上述四大菌门。

代表性分离株包括：Lactobacillus murinus、Staphylococcus xylosus、Enterococcus faecalis、Bacteroides acidifaciens 等。

该方法同样适用于其他组织（如肝脏）及人体样本（如角膜拭子），提示具有一定的组织通用性。

方法学评价：优势与局限

优势

1.直接提供活菌资源：获得的纯培养物可用于后续功能验证（如代谢产物分析、共培养实验、体内回补）。

2.系统发育覆盖广：四种主要菌门均可检出，避免了单一培养基的选择性偏差。

3.可重复性强：详细列出培养基配方、培养条件、对照设置，便于他人复现。

局限性

1.半定量性质：无法确定瘤内细菌的绝对丰度，仅能报告“有/无”。

2.培养偏向性：部分难培养共生菌（如 Clostridia 某些分支）仍无法被现有条件捕获。

3.样本限制：溃疡性或坏死性肿瘤因暴露于环境菌群，不适用该方法。

4.人力成本高：有氧/厌氧流程需两人协同操作，时间窗口紧张。

对领域研究的启示

填补了“肿瘤微生物组功能性研究”中缺失的一环，从核酸信号走向活菌实体。

结合其团队此前在Cell上发表的“瘤内罗伊氏乳杆菌通过色氨酸代谢物I3A激活CD8⁺T细胞AhR信号”的工作，可以看出：培养组学不是终点，而是起点。 它为后续机制验证提供了可操作的菌株资源，也为“肠道-肿瘤轴”中细菌迁移假说提供了直接的培养证据。

未来改进方向可能包括：

引入更高通量的自动化培养系统；联合单细胞分选或微流控技术实现定量；针对特定肿瘤类型优化裂解条件以减少宿主 DNA 干扰。

实用建议

对于计划开展同类工作的研究者：

1. 提前准备足够多的培养基种类，宁可多不可少，避免遗漏稀有菌门。

2. 严格分区操作：有氧与厌氧操作台分开，工具灭菌频率提高。

3. 保存所有分离株：甘油冻存管 -80°C 保种，便于后续功能筛选。

4. 记录每块平板的菌落形态，辅助后续分子鉴定时的初步分类。

Q1：我没有培养组学体系，能做吗？

A： 可以。唯那生物提供全托管分菌服务，您只需提供新鲜或低温保存的样本，后续所有步骤由我们完成。我们会根据样本类型和目标菌群，配置6至12种培养基，有氧与厌氧双轨并行培养，然后进行肉汤富集、平板划线、纯化，最后通过16S rRNA全长测序和NCBI比对完成鉴定（98%以上定种）。每个分离株制备两份甘油冻存管，一份随报告返还，一份留档。最终交付内容包括培养记录、序列峰图、鉴定结论和活菌冻存管。

Q2：只能做小鼠肿瘤吗？其他样本行不行？

A： 都行。已成功处理过动物组织、人体活检、粪便、土壤、水体、食品等多种样本。前处理方案会根据样本类型调整，但核心的多培养基搭配、有氧厌氧并行、两步扩增、分子鉴定框架保持不变。

Q3：自己做和委托你们，差在哪？

A： 自己做需要采购二十多种原料配制培养基，耗时三五天；需要购置厌氧工作站，投入数万元；容易忽略对照设置导致假阳性；送测序鉴定通常排队五到七天。委托我们：成品培养基即配即用，自有进口厌氧工作站，严格执行双对照体系杜绝假阳性，48小时出鉴定结果，预算可控且出菌率有保障。尤其适合首次开展培养组学的课题组。

Q4：能定向分离某个菌属吗？

A： 能。通过选择性培养基（如MRS富集乳酸杆菌、BBE富集拟杆菌）、抗生素添加剂、温度pH调节、预富集策略，可实现靶向分离。您只需告知目标菌属或功能特征，我们设计专属方案。

Q5：分离完还能做什么？

A： 可衔接全基因组测序、比较基因组、转录组、代谢组、蛋白组分析，以及突变体构建、Tn-Seq筛选、体外共培养、体内回补等功能验证。例如分离到一株疑似抗肿瘤的乳酸杆菌，我们可以帮您完成全基因组测序、代谢物检测、突变株构建和无菌小鼠模型验证——培养组学是起点，功能验证才是终点。

支持单位：