据 ClinVar 数据显示，人类的遗传病中58%是由于单个碱基突变引起的。

虽然Cas9激活的同源重组可以实现对突变位点的精确修正，但效率非常低（ 0.1%~5%），严重阻碍了其应用。

而通过将胞嘧啶脱氨酶与nickase Cas9（D10A）融合而成的胞嘧啶碱基编辑器BE3(Cytosine base editor, CBE), 在不引入 DNA 双链断裂同时也不需要重组修复模板的情况下对编辑窗口（距离PAM远端起的第4-7位）内的胞嘧啶脱氨，实现C>T的碱基转换，具有更加安全、高效、精准的特点，在基因治疗，农作物遗传育种，药物筛选等领域展示了广泛的应用前景。

自CBE被发明以来，多种策略对其进行了优化改进，虽然这些方法一定程度上提高了CBE的活性，但是对于编辑窗口的影响不大，特别是更靠近PAM序列的碱基仍然很难被编辑到。

因此，是否有新的策略可以提高编辑活性而又能扩增靶向碱基的范围，一直是碱基编辑器优化的难点。

由于CBE主要是以单链DNA（ssDNA）为底物，因此研究团队猜测如果增强脱氨酶与ssDNA的结合能力，是否能增加脱氨酶作用时间而增强活性呢？

于是，通过对10个非序列特异性的ssDNA结合结构域（ssDBD）与CBE进行融合，通过筛选，发现将Rad51蛋白的ssDBD融合到APOBEC1与Cas9n之间能显著提高碱基编辑活性，同时编辑窗口也大幅增加（图1）。

通过10个靶点的分析，在编辑窗口C4-C8中，hyBE4max比BE4max活性提高了1.5-2倍，而在C9-C15这些更靠近PAM的碱基中，活性最多提高了18倍。

 图1. hyCBE模式图及对不同ssDBD的筛选结果

为了验证融合ssDBD的策略是否具有通用性，用类似的方法改造A3A-BE4max和特异性识别TC motif中C碱基的eA3A-BE4max, 获得了hyA3A-BE4max 和 hyeA3A-BE4max。

通过大量的实验证明，相比A3A-BE4max，hyA3A-BE4max活性在C3-C11位点提高了1.2-2倍，C12-C17位点活性提高3-4倍，通过小鼠胚胎显微注射也进一步证明其在编辑更靠近PAM序列的碱基的独特优势。

与eA3A-BE4max 相比，hyeA3A-BE4max任然能非常特异性地靶向TC motif中的C，编辑窗口由C4-9拓展为C4-15，活性最高提高了 257倍，而在小鼠胚胎中在C13位的编辑活性也提高了近60倍，F0代小鼠获得DMD纯合点突变的效率达到40%。

论文进一步验证hyCBEs特别是hyeA3A没有检测到DNA或者RNA层面的脱靶，具有非常高的精准性。

最后，通过比较多种CBE在编辑胎儿血红蛋白（HBG1/2）启动子-117位点的能力发现，hyeA3A能在红细胞前体细胞系中精确催化-117G>A的转换，而周围同时发生碱基突变（by stander mutation）的细胞相比，具有更高的HBG表达水平，展示了 hyeA3A-BE4max 对于精准治疗β-血红蛋白病的巨大潜力。

该工作开发了能提高编辑活性拓宽靶点范围的一些列新的CBE，为基础研究与基因治疗提供了新的优化工具。

华东师大生命科学学院博士研究生张晓辉、硕士研究生陈亮和博士研究生朱碧云为该论文的共同第一作者。

华东师范大学为第一作者单位，李大力教授为本文通讯作者。

刘明耀教授对本课题给予了悉心的指导，同济大学毛志勇教授课题组在实验室提供了重要支持。

该研究受到了科技部重点研究发计划、国家自然科学基金以及上海市教委重大项目等经费的支持。（黄辛）

相关论文信息：

DOI：10.1038/s41556-020-0518-8