景杰编者按：质谱序技术可以对复杂样品中蛋白质的浓度和共价修饰进行平行地测量。 最近，通过同时测定数千种蛋白质的热变性曲线，质谱的这方面的应用已经扩展到探测蛋白质组的三维结构和构象状态。虽然许多动物及其常驻微生物存在于相对狭窄，受调节的生理温度范围之内，但植物所处的环境经常会剧烈的温度变化，这可能影响蛋白质热稳定性的进化与演变。

威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系的Michael R. Sussman教授在Molecular & Cellular Proteomics杂志上发表文章，通过质谱首次深入研究了拟南芥的热蛋白质组。 研究者通过使用六个生物学重复，分析了1700多个拟南芥蛋白的溶解曲线，观察到蛋白质热稳定性与许多已知蛋白质特征之间的显着相关性，包括蛋白分子量相关性和带电氨基酸、极性氨基酸的比值相关性。研究者还发现了植物26S蛋白酶体核心和调节结构域的热稳定性差异，这可能反映了温度胁迫期间蛋白质转换受调节方式的独特性质。

实验思路：

研究者采用六组生物学重复，利用高通量蛋白组学分析结合质谱（Mass Cytometry）、生物信息学分析的方法在拟南芥中鉴定到4246个蛋白，利用热蛋白组（Thermal Proteome Profiling）分析Tm经验值与蛋白质热稳定性各种可能的物理化学决定因素之间的相关性。

1. 热蛋白组使用同位素编码的基于质谱来同时分析上千种蛋白质。

将十份样品置于温度梯度上温育，并将上清液进行十通道同量异位标记。 使用标准的基于MS / MS的定量来测量蛋白质水平相对丰度值。这个值适合于所描述的双态模型。

 Figure 1. 热蛋白组的工作流程

2. 热稳定性特征

研究者检测了每个定量蛋白的八种化学和结构特征，来研究其与特稳定性的关系。这些特征包括：分子量、蛋白丰度、脂肪指数、等电点、相对疏水性、带电与极性残留偏差（CvP）、预测的二级机构组成以及20种标准氨基酸的相对含量。所有这些特征要么通过计算，要么通过氨基酸数据库预测。在这些特种当中，分子量、疏水性、带电与极性残留偏差、alpha螺旋和beta片层的含量跟相对热稳定性呈显著相关性。

 Figure 2 蛋白溶解温度和潜在协变量的关系

3. 拟南芥的蛋白酶体

研究者在基因集富集分析中观察到蛋白酶体亚基富集在最低和最高的bins。 因此，研究者仔细研究了每种蛋白酶体蛋白的Tm分布，发现核心和调节亚基之间的热稳定性存在显着差异。许多蛋白酶体亚基在拟南芥基因组中作为多个旁系同源物存在，并且本数据中模拟了大多数亚基的至少一个同源物。 所有建模的核心亚基在蛋白质组范围的上端具有Tm值，而所有调节亚基Tm值都在较低的区域中。

 Figure 3 26S蛋白酶体亚基的溶解温度

4. Mg-ATP 处理后的热稳定性变化

为了阐述热蛋白组适用于Mg-ATP处理后植物蛋白的构象变化，研究者利用热蛋白组分析了control 和Mg-ATP处理过的拟南芥裂解液，并用已有的蛋白功能注释计算和比较了Tm值的变化。

Figure 4 Mg-ATP 处理后的热稳定性变化

本文采用了高通量蛋白组学分析结合质谱和生物信息学分析的方法，找出了高脂饮食组小鼠卵母细胞中的差异表达蛋白，鉴定出潜在关键效应因子。蛋白组学分析表明TIGAR蛋白在高脂饮食小鼠卵母细胞中显著下调，并且TIGAR的表达可以降低高脂饮食小鼠卵母细胞中的氧化应激。本文通过Western blot的方法对组学数据做了鉴定，表明组学数据的正确性。另外，本文通过敲低和过表达TIGAR揭示了其在ROS调节、自噬过程中的作用。

研究者使用六个生物学重复质谱和生物信息学分析的方法在拟南芥中鉴定到4246个蛋白，首次研究了拟南芥的热蛋白质组。利用热蛋白组分析Tm经验值与蛋白分子量相关性、氨基酸带电与极性残留偏差因素之间的相关性。研究者还发现了植物26S蛋白酶体核心和调节结构域的热稳定性差异，这些发现跟之前的报导基本一致，但在某些方面具有显著差异。这部分工作给研究者们打开了探寻蛋白-配体互作的新大门，为研究遗传与环境因子对植物蛋白构象影响提供了更多可能。

参考文献：

 Volkening JD, et al., 2018, Proteome-wide analysis of protein thermal stability in the model higher plant Arabidopsis thaliana, Molecular & Cellular Proteomics

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