景杰编者按：脂质的代谢涉及许多功能上独特的细胞器，如细胞质膜、ER、线粒体、过氧化物酶体、溶酶体以及脂滴（LD）等。这些细胞器为多种生化反应提供了单独的隔室，这些隔室都具有高度动态的结构，其成分和相互作用都是可以改变进而适应环境变化和代谢的挑战。

在肝脏中，脂质溢出会导致各种疾病，严重程度从轻度肝细胞增多症到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），更有可能会导致肝功能衰竭，尽管在脂肪肝中已经报道了ER应激和线粒体功能障碍，但仍然不清楚脂质积累如何影响蛋白质定位，细胞器结构和相互作用。

总的来说，蛋白质组成是控制细胞器功能的关键因素，并且由不同的机制决定，因此了解肝脏脂质积累如何影响细胞器蛋白质组成及其翻译后修饰对健康和疾病的代谢具有广泛影响。常规的细胞蛋白质组学研究和翻译后修饰研究具有一定的局限性，因为它无法模拟真实的体内情况，再加上大规模样本情况下抗体的不可用性，迫切需要一种解决方法。

今天为大家解读一篇细胞器蛋白质组学与磷酸化修饰组学，揭示营养物质超载导致细胞器重组新机制的文章，文章2018年10月22日发表在国际专业学术期刊Developmental Cell上。研究者利用基于质谱的蛋白质和磷酸肽相关性分析方法，去检测6000个肝脏蛋白和16000个磷酸肽的变化及其在细胞中的分布。

研究发现在脂肪肝中，许多细胞器接触位点蛋白都靶向到脂滴（LD），对细胞器产生了束缚作用，重新调整了脂质代谢，整个分泌途径的蛋白质也显著发生了重新分布，包括COPI复合物的错误定位和LDs中的高尔基体的分离，这些都与肝脏蛋白分泌减少有关。该研究为未来临床上治疗脂肪引起的肝脏功能疾病提供了新的指导方向。

1、 高脂喂养条件下的代谢重编程

研究者选择小鼠作为动物模型，实验组分别在第3周（早期时间点）或第12周（晚期时间点，12周后，脂肪肝已经形成）喂养高脂饮食（HFD），对照组保持低脂饮食(LFD)，所有小鼠在16周龄时以随意喂养状态处死（图1-A）,然后对小鼠肝脏进行了Label Free定量蛋白质组学分析，共鉴定到了7394种蛋白质。

图1-A 对高脂喂养小鼠肝脏进行Label Free定量蛋白质组学分析

在进行一系列严格过滤后发现有超过12%（784）的蛋白质发生了显著差异调节，其中参与脂肪酸合成和转运的蛋白含量均发生了上调，大多数溶酶体水解酶的蛋白丰度在HFD晚期降低了2到4倍，这可能是由于长时间脂质暴露后自噬的失活。此外，调节染色质形成，转录，mRNA加工和翻译过程中涉及到的许多蛋白在HFD条件下丰度有所降低（1.5至3倍），因此全蛋白质组结果表明高脂喂养影响蛋白质表达和降解，同时蛋白酶体组分也被上调（2至6倍）（图1B）.

图1-B HFD条件下蛋白质组改变引发代谢重编程

2、 蛋白质重定位和相关细胞器特异性磷酸化的定位图谱

为了更好的探究HFD诱导的细胞器组成变化，研究者采用了PCP(protein correlation profiling)这一新型蛋白质研究方法，它可以将所鉴定到的蛋白质无偏差的分配到多个亚细胞定位。

研究者分别在实验早期（3周）以及脂肪肝形成时期（12周）对三组小鼠肝脏中细胞器蛋白变化以及特异性磷酸化变化进行了比较，肽谱图分层聚类显示在所有三种条件下，细胞器的高强度峰值高度相似（图2A和B），但是在HFD早期时间点中发现有350种蛋白（7.5%）发生了重定位，并且这350种蛋白在晚期时间点会再次发生重定位；在HFD晚期有910（21.5%）种蛋白发生重定位，这910种蛋白有30%被隔离到LDs（图2C）。

图2 HFD条件下蛋白定位和细胞器特异性磷酸化分析

在磷酸化水平上我们共鉴定到2302个蛋白的16000个位点在HFD晚期时间点发生了磷酸化变化，这些变化位点中有240个位于重定位蛋白上，35%位于重定位LD蛋白上（图2D）。所以，这些位点上的磷酸化变化可能诱导蛋白质重定位或者是与新区室中特定激酶发生相互作用。

3、 长期HFD诱导的LD蛋白质组的变化和细胞器间接触的形成

在短期HFD我们观察到全蛋白质重定位没有受到影响，但与细胞信号传导途径的几种重要调节因子如PRKACA，KRAS，RAF1，GNAS或ARRB1都发生了显著的特异性定位变化，组织细胞骨架或参与囊泡运输和脂质代谢的几种蛋白质也表现出显著的重定位变化。

与短期HFD相反，当脂肪变性出现时，整个组织结构和功能蛋白质种类受到影响，其中很多都出现在LDs上，标准蛋白聚类把这些蛋白分为了4类（图3A）。

图3A 标准蛋白聚类分析将蛋白分为4类

I类蛋白与饮食无关，在HFD LFD下LD中均可以检测到；在LFD期间II类蛋白存在于LD上，在HFD期间他们量减少，这类别中有许多细胞骨架蛋白；III类和IV类蛋白在HFD下增加了其LD定位，III类主要是细胞外基质，高尔基体和参与囊泡运输的蛋白质，与III类蛋白不同的是IV类蛋白只有一小部分只定位在LD上，表明IV类蛋白具有双重亚细胞定位（如ER和LD）或者定位于与LD特异性互作的细胞器膜结构域（图3B）。

实际上，在HFD的晚期时间点，ER，线粒体，质膜和核标记物中明显出现了这种引起额外LD峰的库。这表明在长期HFD下发生或加强了细胞间接触。

图3B HFD条件下LD中蛋白质组的改变

4、 长期HFD诱导高尔基体结构和分泌功能的变化

HGD 12周后虽然总的高尔基体蛋白水平并未发生改变（图4C），但是大部分完全已经重定位到LDs中（图4A）。实际上在LFD和3周HFD期间所有的高尔基体标志物相关蛋白都失去其特征性细胞器峰并转移到LD部分（图4B）。

图4 HFD条件下高尔基体结构和功能的改变

COPI和COPII复合物分别介导高尔基体和ER之间的逆行和顺行运输。之前的研究表明COPI复合物是最显着富集的重定位蛋白类别之一。

通过对HFD 12周后分离的原代肝脏细胞分泌蛋白的检测可以发现，相对于LFD原代肝脏细胞，其上清液中分泌蛋白显著减少（图5C和5D）,而HFD 3周后的原代肝脏细胞并无变化（图5A和5B）。在测定前，脂肪酸存在下来自HFD小鼠的原代肝脏细胞分泌蛋白减少的更明显（图5E和5F），若在无血清培养基中饥饿数小时后，细胞完全从分泌缺陷中回复（图5G和5H），说明高尔基体这种功能的丧失是可逆的。

图5 HFD条件下蛋白分泌减少

随着生命科学技术的发展，蛋白质组学和翻译后修饰组学已经越来越多的应用到临床研究中，对疾病的患病机制以及新药物的开发都提供了更多的可能。本项研究中，研究者巧妙的利用蛋白质组学和修饰组学技术对小鼠体内的细胞器进行了探究，揭示了营养物质超载如何导致细胞器重组和细胞功能障碍，不仅在蛋白质领域开创了新的篇章，也对脂肪肝的临床研究提供了一个新的思路，在未来可能会对脂肪积累相关疾病的治疗提供一定的指导意义。

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参考文献

Natalie Krahme, et al., 2018, Organellar Proteomics and Phospho-Proteomics Reveal Subcellular Reorganization in Diet-Induced Hepatic Steatosis, Developmental Cell.