自闭症谱系障碍是一种神经发育疾病，其特征是社交和沟通困难、限制性和重复性行为以及异常的感觉反应。

自闭症的具体发病机制尚不能明确，但目前为止许多研究表明，自闭症与肠道微生物组之间存在很大关联性。

最新，Yap等人发表于Cell的一篇题为“Autism-related dietary preferences mediate autism-gut microbiome associations”的论文就自闭症与肠道菌群的关联给出了他们的研究成果。

其核心结论是：

肠道菌群与自闭症之间没有直接联系。自闭症儿童与正常儿童的肠道菌群差异是由于自闭症症状导致患儿的饮食多样性下降，饮食类型狭窄，从而导致肠道菌群多样性减少，进而引发便秘和消化道症状。

经过对论文的详细阅读，我们认为该结论的适用范围和可靠性需要进一步商榷。

我们来看看其研究设计情况。

关于肠道菌群这方面的研究，很关键的一个点是研究的样本数量。

01

样本数量有限，统计效力存疑

首先，这项研究涵盖了共247名儿童（2-17岁），其中自闭症患者99名，51名患者的兄弟姐妹，97名非自闭症儿童，样本来自澳大利亚自闭症生物银行Australian Autism Biobank (AAB)。

我们观察到样本人群相对于宏基因组来说样本数量还可以，但是99例自闭症患者样本还是让整个研究的统计效力及研究的适用范围有很大限制。

02

自闭症和队列样本年龄分布与自闭症发生年龄段不一致

自闭症属于神经发育疾病，虽然其病因复杂，但是疾病的发生阶段绝大部分在出生到3岁左右，主要影响了儿童早期的神经系统发育，导致出现神经发育滞后、刻板行为和社交障碍。

类似的疾病还有注意力缺陷ADHD以及多动症等。越早期的干预其愈后和改善就越明显，因为早期神经系统发育是阶段性的，错过了发育阶段，很难在后期通过行为学等方面获得明显改善。

进一步查看研究样本的年龄分布我们发现，该研究的样本年龄均值在8.7岁。

虽然范围在2-17岁，但是和自闭症发病阶段3岁以下的各组样本分别是7例、7例和8例，2岁以下的样本仅有1例。

也就是说，研究涉及的自闭症患者虽然仍然有着自闭症的诊断和行为表现，但是绝大部分样本均不是处于神经发育的最核心阶段，而且大部分样本应该是经历过多年的包括行为干预或其他治疗。

因为自闭症与早期行为发育相关，大部分确诊儿童可能其行为表现和社交能力直到成年可能仍然没有完全恢复或达到正常水平，可能在多年后即便其引发自闭症的病因（主要是环境或生理因素）已经消失，但症状或诊断仍然没有变化，这就意味着这些样本可能不能反映真实的自闭症发生时的神经发育和菌群状况，因而也不能说明菌群在自闭症的发病和发展过程中并无联系。

更重要的是肠道菌群的组成变化尤其是生命早期与年龄和发育阶段密切相关，3岁之前的肠道菌群基本上每个月龄都存在变化，3岁之后的肠道菌群会趋向于接近成年人的菌群构成，并逐渐成熟。

还需要注意的是，在6个月左右，由于固体辅食的引入，婴幼儿的饮食结构会发生重要变化，相对应的肠道菌群也会发生重要的转变，从乳制品代谢为主的韦荣氏菌、双歧杆菌、大肠杆菌为主逐渐进入以碳水化合物和蛋白质代谢为主的拟杆菌或普雷沃氏菌属等成年人常见核心菌群为主的菌群构成。这一变化阶段恰恰是自闭症对应早期神经发育的最重要阶段，而该研究基本没有这个阶段的样本。

研究中也明确提及肠道菌群构成和年龄存在较强的相关性，在分析中是将年龄和性别作为协变量进行控制，但我们认为这种统计方式不足以解决儿童肠道菌群在不同年龄阶段的变化差异，需要进一步对不同年龄阶段或年龄的儿童进行单独分组分析，但是这样该研究的样本数量就严重不足以获得足够的统计效力。

03

配对家庭样本分析存在疑问

研究中包含有来自同一家庭的非自闭症兄弟姐妹，作为对照能较好的控制包括饮食、生活方式及居住环境等变量，因此很自然我们希望看到针对成对家庭兄弟姐妹的比较分析。

在论文的补充材料方法部分有描述了使用成对样本进行比较的内容，一个102个样本，形成51对样本。对于这样的成对样本分析，比较简单的方式是直接进行成对T检验。

然而，论文中并没有这么做，比较奇怪的将family ID作为随机变量从而控制成对样本的差异检验。但是家庭ID本身除了家庭之外并没有类似年龄或分层等信息量，作为随机变量加入后并不能有效实现成对分析的效果。

另外根据论文的结论，饮食结构单一引起了菌群的变化，进而诱发肠道问题，那么在成对家庭成员样本之间，自闭症儿童相较于同家庭的兄弟姐妹在相同饮食习惯和环境下是否饮食结构明显单一呢？

我们期待看到自闭症儿童的饮食多样性要显著低于其兄弟姐妹，且基本集中于低多样性的区间。

论文补充材料部分的下面这张图显示，同家庭兄弟姐妹之间的饮食多样性是显著相关的。

那么对应的菌群多样性呢？下面的图显示，基本没有相关性。

由于论文没有进行成对样本的检验，因此我们尝试下载数据进行单独分析，很遗憾，论文中提供的数据仅包括100例样本的数据，表型和分组等信息只有50例样本的，无法进行单独分析。

针对论文结论的自闭症儿童的饮食类型狭窄的问题，我们认为在早期婴幼儿期饮食构成本身就是相对单一的，而且非自闭症儿童中也存在相当一部分饮食结构单一的，单以饮食结构问题来解释自闭症儿童的菌群差异还不具有足够的说服力。

04

菌群数据的过滤筛选对结果的影响

另外我们注意到，该研究将菌种和后续的基因及代谢途径分为常见和罕见两组，其中种部分中位数大于0的作为常见的，一共96个，其他的有607个种作为罕见。

另外在后续对功能基因的分析时也是将分析集中于前面发现的Romboutsia timonensis菌种相关的基因。

当然这是受限于样本数量的因素，聚焦于普遍的高丰度的菌属和基因，但是也有很大可能丢失了可能的联系。

综上，文章否定的是菌群与自闭症之间的直接关联，与之相关文章识别到了自闭症与健康儿童间的差异菌（Romboutsia timonensis，经过年龄、性别、饮食偏好调整之后），以及菌群与重复刻板行为存在显著相关（Fig. 4H）。

在这样的事实前面，文章依然要强行否认自闭症与菌群的关系，作者的行为很让人费解。

众说纷纭

对此，网友们也各抒己见，就该文发表了一些见解：

他们的研究甚至没有试图确定：微生物群是否在自闭症谱系障碍中起驱动作用 

他们自己的研究需要收费，这让事情更糟糕。 人们必须付费去看他们的研究...

我们认为，以下系列问题仍有待回答：

1.  他们的自闭症儿童都属于主要集中在轻度或者边缘程度，这个样本选择是否能代表自闭症的全部群体还存疑；

2.  如果将饮食归因于挑食等问题，那么在临床实践中我们也经常看到正常孩子也有挑食。研究者如果要说明菌群和挑食等行为有关而不是自闭有关，那么应该要设置一组挑食的健康对照儿童，才能彻底屏蔽这个因素的可能影响；因为作者明确表示饮食和自闭症有关，而不认为菌群和自闭症有关；

3.  这些样本的分布是否有跨地区特点？如果有，那么区域也会带来极大的差异，如菌群、饮食习惯等等，如何规避这个的影响？

《cell》原文：doi.org/10.1016/j.cell.2021.10.015

本文转自：谷禾健康