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从孟德尔到印德尔（InDel）精选

已有 14086 次阅读 2013-6-1 04:15 |系统分类:科研笔记| 孟德尔

孟德尔通过长达8年的豌豆实验，提出了分离和自由组合定律，然而由于其超前的思维和独特的实验方式，并不被当时人们所理解和接受，他用心血所灌溉的成果直到35年之后1900年，由三个国家三位学者独立“重新发现”后，人们才逐渐接受他这一划时代的发现。孟德尔试验成功有多方面的因素，其中重要一点是他对遗传多态性的使用达到了出神入化地步。在整个实验过程中，他选择了可以相互区分且能稳定遗传性状，如高茎或矮茎、圆粒或皱粒、灰色种皮或白色种皮等。这些高矮、圆皱、灰白就是遗传学上的多态，称之为形态标记。

然而，1936年，英国著名群体遗传学创建者R. Fisher发表了一篇重磅论文《孟德尔的工作是否已被重新发现》，作者根据孟德尔论文记载的实验数据，通过统计学的方法进行验证，发现孟德尔的数据好得令人起疑。在孟德尔试验数据中，共使用豌豆8023株，其中显性6022株，隐形2001株，显性和隐性的数据结果实在是太好了。根据统计学原理，出现这么好的数据的可能性大概是98.86%，换句话说，一万个人做试验，大致9996个人做的试验数据没有孟德尔做的这个好。事实上，即便在性状判断上，也存在着一个标准尺度问题，比如一颗豌豆是否发生皱缩，很难说的准确。很多人可能不相信，那么您去看看我的博文“突变之美”，玉米籽粒都已经皱缩到那个程度了，从外观上看应该是突变体了吧，但是当以分子标记检测时，并不是突变体。当时对遗传因子的判断只能从外观上进行，显性的杂合极有可能被当做隐性的纯合，尤其是孟德尔选择的遗传群体数量并不足够大，近乎3:1的比例实在是太完美了。

孟德尔实验数据受到质疑一个重要因素就是由于形态标记的局限性，形态标记不仅仅受遗传因子的控制，周围环境的变化对其也有重要的影响。虽然形态标记在遗传群体中分离明显，肉眼清晰可辨，在构建经典连锁图谱和基因初步定位中发挥了重要作用，但其数目十分有限，在水稻中经过几代科学家上百年的努力也只积累了约300个形态标记。1980年美国遗传学家Botstein首次提出以DNA限制性片段长度多态性（RFLP）作为分子遗传标记，从而使遗传标记摆脱了形态学标记数目少的困扰，进入了DNA水平时代。随着PCR技术成熟和测序技术的快速发展，基于PCR的遗传标记RAPD、CAPS、AFLP、SSR和InDel等在动植物育种、遗传多样性分析和基因功能组学上发挥了越来越重要的作用。这些标记不仅数量众多而且遗传稳定，不受环境因素制约。

InDel (insertion-deletion) 插入缺失标记，指的是同一物种不同个体间，在同一位点的DNA序列处发生了核苷酸片段的插入或者缺失，在该位点两侧设计特异引物进行PCR扩增，不同个扩增出来的片段大小会存在差异，即我们所说的多态。在我基因克隆过程中，共开发SSR标记78对，InDel标记228对，二者相比，InDel标记除共显性好、重复性好和多态性丰富特点外，以该标记进行PCR扩增，非特异性条带少。目前随着高通量测序技术的发展，很多物种都进行了重测序数据分析，因此对于获得个体是否有插入或者缺失片段变得非常容易。

玉米中InDel分子标记的开发，我们以玉米基因组B73为参照，同时结合国内六个玉米品系重测序数据，以Bowtie进行拼接，找出了各个位点下缺失或者插入，当然我们有自己的服务器，所以拼接很快。当运算完成后，以Putty远程登录服务器，通过Xming软件对不同玉米自交系间基因组序列进行比对，找到InDel区域，前后选择一段序列，以NCBI在线设计引物。下面是具体的开发过程。

Putty参数设置页面，选择自己喜欢的字体颜色等，设置好参数保存，点击打开：

打开之后输入进入服务器数据库的密码，输入密码前页面：

进入数据库之后，通过一系列指令程序，找到分析好的序列：

对缺失序列的寻找，前面通过Bowtie搜索出那些位点的有缺失或者插入，输入相应的位点，就可以找到缺失的地方，如下图。

在缺失位点两侧选择一段序列，我一般都是在缺失前后两侧各选150bp序列，然后输入到NCBI在线引物设计，进行引物的设计。引物合成后，以BSA或者近等基因系的方法进行引物多态筛选，筛选PAGE图如下，当看到图中的InD199和InD200，您是否会高兴的跳起来，这两个标记肯定可以用3%的琼脂糖胶来跑啊：