JAK-STAT signaling pathway(I)

又是实验的空档，又有些空闲的时间，又想突破一个一直堵在心里的障碍：激酶相关的信号通路。之所以一直是个坎，是因为从前听说过却没有亲自做过，总是觉得这是个超级复杂的领域，因为“路口”太多。近期在Email Alert中多次看到JAK出现，想停下来看一看，这个激酶到底是怎么工作的，是如何转导信号的？在治疗癌症的过程中有哪些角色？与自己曾经做过的课题和听过的报告有何关系？关于该靶点的药物有哪些种类？在免疫疗法中是否有独特的功能？如何研究这类激酶的通路？如何发现的？与其他信号通路的crosstalk如何？等等。

稍稍在网上搜索一下，就可以简单的看到“JAK-STAT”的信号通路主要分三个部分：细胞表面的受体，一个激酶（Janus kinase，JAK）和一个信号转导和转录激活的因子（Signal Transducer and Activator of Transcription, STAT）将细胞外的信号传递到细胞核内部，激活下游靶基因的转录，其中包括一些关于免疫、增殖、分化、凋亡和癌基因。一些配体如干扰素（IFN）、白介素（IL）和生长因子（GF）与JAK相关联的受体结合后可以激活JAKs，接着磷酸化自身Tyrosine；之后带有SH2结构域的一些蛋白便可以与之结合，其中比较流行的就是带有SH2结构域的STATs；之后STATs的Tyrosine可被JAK等酪氨酸激酶（TyrosineKinase, TK）磷酸化，之后便拥有了进入细胞核内的“金牌”，行使信使的功能，激活下游诸多的靶基因。（FromWikipedia）

Key elements of the JAK-STAT pathway (By Peter Znamenkiy)

在刚入职的时候就听说一个可能是“Janus”的大型仪器，可以转移0.1 nL的一个自动化的液体转移工作站，感觉很是高大上。原来Janus是罗马神话中诸神中的一位“两面神”或“天门神”，早上开门之后阳光普照，夜晚关门之后黑暗降临（记得Apollo是希腊神话中的太阳神，感觉更温暖、亲切）。看着她的名字多少能猜出她的功能或结构：一方面自身磷酸化激活下游通路，一方面又能负调节自身的磷酸化水平，又或许与她自身拥有两个结构几乎相同而功能却截然相反的结构域有关。

无意中看到一篇介绍JAK-STAT通路的文章（Stark G R, Darnell J E. [J]. Immunity, 2012），文章的作者总结了多年来关于该通路的研究，并且回顾了许多历史性的事件。起初文中的两位作者有着各自的研究方向，直到1980s后期，二人独立的研究被这个通路连接在一起。一个研究DNA结合蛋白的功能发现了STATs，一个利用基因组分析的方法研究细胞内基因的新功能，发现了JAKs。二人同样有着长达30余年的合作和友谊关系，曾在1990s期间共同发表十余篇文章。

（From Stark G R, Darnell J E. [J]. Immunity, 2012）

原来，JAK-STAT通路起源于IFN的发现（是不是很有意思）。早在1957年，Alick Isaacs 和Jean Lindenmann报道了一种“病毒干扰”的现象。他们发现细胞在病毒感染之后释放了一种物质，影响了后续病毒对细胞的感染能力。但当时他们还不清楚具体是什么物质，一番努力之后只是初步知道这不是病毒的组分，而是细胞释放的。分析她的化学成分后推测这应该是分子量较小的蛋白，并为之命名为“Interferon”（也就是干扰病毒的一种物质，俗称为“素”，即干扰素，IFN。）早期的实验室利用鸡胚和流感病毒进行的，后来的研究发现IFN对于其他的RNA病毒同样有着抑制作用。Isaacs 和Lindenmann的研究有着两个明显的提示：细胞内存在一种固有的宿主防御系统在病毒侵染后被激活，释放一种物质能够抵抗后续病毒的侵染；这种被细胞释放的小蛋白可在数小时内改变细胞内部许多基本功能。这些非常重要的发现开启了人们寻找内部机制的研究，渐渐的人们揭开了JAK-STAT的面纱，不过那已是三十年后的故事。

停下来看了看时间，原来这个时候才发现DNA的双螺旋结构不久，还并不是很清楚“DNA-RNA-Protein”的中心法则，人们对RNA是如何产生很有兴趣，细胞内对RNA的调节机制就更是模糊不清了。原来和Darnell在一起的同学后来多数成为了大牛，他们始终如一的关注RNA的合成和调节，经过一段博士后的研究，后来又了自己的实验室，开着了各自的研究方向，但彼此的联系和讨论还是很频繁的，这也促成了大家在这个领域中有更多关键的发现。Darnell的课题组主要关注的是RNA的转录调节，他们分理处各个器官里细胞的核，利用同位素标记的办法研究RNA合成的特异性，他们发现许多RNA只有在肝细胞中高效的转录，由此开始专注于RNA转录的调控。

一个重要的进展就是名为PeteKnight的PhD纯化到IFN-β，并且发现经IFN-β刺激的人成纤维细胞可在数小时后合成一种新的蛋白，在2D的蛋白分离胶中可以观察到。而这个蛋白在平时是不会（高水平）表达的，而这种诱导表达的过程可以被RNA合成的抑制剂（actinomycin）所阻止。于是Pete和Darnell等人开始寻找这种特异被IFN-β诱导的mRNA，当他们时用的办法是构建cDNA文库（此时Stark的实验室几乎在用同样的办法寻找被IFN诱导的基因）。大概是1986年附近，Darnell等人发现了若干个DNA结合的蛋白（当时称转录激活因子）在肝细胞中可被诱导高表达。之后的分子克隆和蛋白纯化的结果就可以预料了，首先被获得是~15KD的蛋白，就是ISG15（IFN-β-stimulated gene 15）。接着就是更多的ISG被发现，人们克隆了他们的基因，并且分析了和RNA的合成相关的启动子区域的序列，接着就发现了基因转录起始位点上游100bp左右的那~25bp的高度保守区域，也就是后来命名的干扰素刺激应答元件（interferon-stimulated response elements，ISREs）。这个时候还没有到1990年，不过研究转录的调控的课题组已经很多，让我想起来我们的分子病毒学实验室起家时的研究，正是这种病毒相关的转录激活调控。

研究转录元件，当时有个新的方法就是凝胶迁移实验（gel-shift），专门研究哪些蛋白和一段DNA序列结合。有人发现了一些复合体特异的被IFN诱导表达，合成的速度非常快，并且一直伴随着转录活性升高的过程中。在刺激后1~2分钟可以在细胞质中检测到，之后便积累在细胞核内。这个复合体中有一个分子量相对较大，因为在gel-shift实验中shift的速度较慢，后来被命名为ISG3。这个时候人们已经知道IFN有多种类型，常见的就是IFN-α, β和γ。而那时有另一重要的发现，Thomas Decker和Danny Lew等人发现被IFN-β诱导的ISGs并不响应IFN-γ的刺激。其实他们已经知道IFN-γ可以诱导许多基因的转录和翻译，其中也包括ISG3。到这我们也能猜到这两种IFN激活的应该是两套通路，却得以激活相同的靶基因的转录水平。

为了更为详细的研究IFN相关的信号通路，人们开始了大量的ChIP实验，希望得到更多与ISRE结合的蛋白。到这一步，有一位关键的PhD上场了，Chris Schindler。多次可以重复的实验发现，有几个蛋白能与特定的ISRE结合，大小包括113,91,84和48KDa的几个蛋白质。关于这些蛋白的详细鉴定不在此赘述，个人只是觉得人们使用³²P标记确定了几个蛋白的磷酸化及其位点，并且利用小分子抑制剂确定了该通路中的激酶是酪氨酸激酶，而非丝氨酸激酶，这些都需要夯实的基础研究数据。人们发现经IFN-α刺激的细胞中，有大量的³²P积累在84,91和113KDa的蛋白中，而经IFN-γ刺激后，仅仅发现了91KDa的蛋白中有³²P，在Y701上。

突出这几个数字，是因为我终于看到了STATs，此时是1993年前后。STAT1就是这个91KDa的蛋白，而那个113KDa的蛋白就是STAT2。经过作者风趣的言语，原来STAT不仅仅是signal transducer and activator of transcription，他的妻子了解这个过程是一个快速磷酸化和核定位的过程，她联想到了医院中形容“快速”的词语“STAT”（STAT: A common medical abbreviationfor urgent or rush. From the Latin word statum, meaning 'immediately'），二者有些双关之意，多了一点神秘的色彩，不知自己关注的STAT新闻是否与之同意。曾经我的CR师兄也给MVL一个双关的解释：一个是官方的molecular virology lab，一个是make victory long live！

现在我好像对这个通路有些了解了，简单来说IFN-α可同时激活STAT1和STAT2，而IFN-γ仅可激活STAT1，并不影响STAT2的状态。其实这里面有很多跳跃，比如干扰素的分类？受体的发现？STATs的功能如何被阐明的？很多细节需要另一位大牛的工作，拼在一起才有完整之意，他就是这篇文章的另一位作者George R. Stark，他的工作解开了JAK的角色。他是如何发现JAK的？如何与STAT相关联的？还有哪些关键的成员？希望明天空余的时间能看到答案。

（未完，待续……）

TJ 泰河园

2016年4月18日星期一