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【全文翻译】中科院病毒所发表于《细胞研究》上的文章

已有 2998 次阅读 2020-2-5 15:26 |个人分类:读书笔记|系统分类:科研笔记

【译者按】中科院武汉病毒所这些日子来一直是大家追踪的热点。大家带着放大镜对其进行了许多观察,这也难怪,因为一场与病毒有关的浩劫正在中华大地肆掠。昨天,病毒所官方网站公布了他们最近的最新研究成果,引来了不少争议,也有许多人在进行病毒和专利申请方面的各种科普——这两个方面我都不在行。好在其文章我能找到,也能读懂一些,我理解其专利也是与文章内容密切相关的(如果不是,请指出),于是我今天就认真拜读了一下,顺便全文翻译成汉语。争论的双方,如果在不明确争论内容的时候,也许是没有意义的争吵。所以,我顺便将这个内容分享给大家,希望对各位有用。如果可能,我以后抽空再对这篇文章进行一些解读。


【说明】原文是一个快报,其版权归原作者所有,本人对只是对文章进行了全文翻译。由于专业差异,本人无法保证对原文进行了最合适的翻译。要看原文,可在原文链接中找到。如果翻译有不妥之处,请善意指出,我并无恶意。谢谢您的配合!



瑞德西韦和氯喹在体外细胞实验中能有效抑制新近出现的新型冠状病毒(2019-nCoV)

亲爱的编辑,

2019年12月,在中国中部1100万人口的武汉市,出现了一种先前未知病原体引发的新型肺炎。最初的病例与暴露于武汉某海鲜市场有关,截至到2020年1月27日,中国官方报告了中国大陆2835例确诊病例,其中81例死亡。此外,在中国香港、澳门和台湾地区发现了19例确诊病例,在泰国、日本、韩国、美国、越南、新加坡、尼泊尔、法国、澳大利亚和加拿大发现了39例输入病例。该病原体被鉴定为一种新型冠状病毒(2019-nCoV),这与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)有很大的相关性。目前还没有针对这种新病毒的特殊治疗方法,因此迫切需要寻找到有效的抗病毒药物来对抗这种疾病。

有效的药物发现方法,是测试现有抗病毒药物是否能有效治疗相关病毒感染。2019-nCoV属于β冠状病毒,也含有SARS-CoV和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。有一些药物,如利巴韦林、干扰素、利托那韦、皮质类固醇,尽管其疗效仍然存在争议,但已经在SARS或MERS患者中进行了治疗。在本研究中,我们评估了5种美国食品药品监督管理局(FDA)批准的药物,包括利巴韦林、喷昔洛韦、硝唑嗪、纳法莫司、氯喹,以及两种广谱抗病毒药物雷米西韦(GS-5734)和法维匹拉韦(T-705)对2019-nCoV的体外抗病毒效果。

这些化合物对2019-nCoVs的细胞毒性、病毒产量和感染率方面的影响进行了标准测定。首先,用CCK8法测定候选化合物在Vero E6细胞(ATCC-1586-)中的细胞毒性。然后,用nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019感染Vero E6细胞,感染复数(MOI)为0.05,在不同浓度的测试药物下进行实验。对照组采用二甲基亚砜(DMSO)。通过定量实时RT-PCR(qRT-PCR)对细胞上清液中的病毒复制数量进行定量测定,并在感染后48小时(p.i.)通过免疫荧光显微镜观察病毒核蛋白(NP)的表达来确定疗效(此时感染时间点的细胞病变效应不明显)。要减少病毒感染,七种测试药物中,有三种核苷类似物:利巴韦林(半数最大有效浓度(EC50)=109.50μμm,半细胞毒性浓度(cc50)>400μm,选择性指数(SI)>3.65),喷昔洛韦(EC50 = 95.96 μM, CC50 > 400 μM, SI > 4.17)和favipiravir(EC50 = 61.88 μM, CC50 > 400 μM, SI > 6.46)是必需的(图1a和补充信息图S1)。然而,尽管favipiravir在Vero E6细胞中的EC50值高达67μM,但它在保护小鼠免受埃博拉病毒攻击方面已被证明是100%有效的,因此建议进一步的体内研究来评估这种抗病毒核苷。Nafamostat是一种有效的MERS-CoV抑制剂,可防止细胞膜融合,对2019-nCoV感染具有抑制作用(EC50 = 22.50 μM,CC50 > 100 μM,SI > 4.44)。硝唑沙尼是一种具有抗病毒潜力的商用抗轮状病毒制剂,可对抗包括人和动物冠状病毒在内的多种病毒,在低微摩尔浓度下(EC50 =2.12 μM;CC50 >35.53 μM;SI >16.76)可抑制2019-nCoV。建议进一步对该药物进行体内抗2019-nCoV感染的评价。值得注意的是,瑞德西韦(Remdesivir)和氯喹两种化合物在低微极浓度下可能阻断病毒感染,并显示出高的SI(图1a、b)。

近年来,瑞德西韦已被认为是一种很有前途的抗病毒药物,可用于抑制培养细胞、小鼠和非人类灵长类动物(NHP)模型中的RNA病毒(包括SARS/MERS-CoV5)的感染。它目前正在临床开发中,用于治疗埃博拉病毒感染。瑞德西韦是一种腺苷类似物,它与新生的病毒RNA链结合,导致早熟而终止。我们的加成时间分析显示,瑞德西韦在病毒进入后的一个阶段起作用(图1c,d),这与作为核苷酸类似物的假定抗病毒机制是一致的。Warren等的研究结果表明,在NHP模型中,静脉注射10μmg/kg剂量的瑞德西韦可使其在血液中的活性持续升高(10μM),对防止埃博拉病毒感染具有100%的保护作用。我们的数据显示,在Vero E6细胞中,瑞德西韦对抗2019-nCoV的EC90值为1.76μM,表明其在NHP中可能达到作用浓度。我们的初步数据(补充信息,图S2)显示,瑞德西韦还有效地抑制了人类细胞系(人类肝癌Huh-7细胞)中的病毒感染,该细胞系对2019-nCoV敏感。

氯喹是一种广泛应用的抗疟疾和自身免疫性疾病药物,近年来被报道为一种潜在的广谱抗病毒药物。众所周知,氯喹通过提高病毒/细胞融合所需的内体pH值,以及干扰SARS-CoV细胞受体的糖基化来阻断病毒感染。我们加成时间分析表明,氯喹在感染2019-nCoV的Vero E6细胞中,进入和进入后两个阶段均能发挥作用(图1c、d)。氯喹除了抗病毒作用,还有免疫调节作用,这可协同增强其体内抗病毒作用。氯喹口服后可广泛分布于全身,包括肺部。氯喹对抗感染2019-nCoV的Vero E6细胞的EC90值为6.90 μM,这在临床上是可以达到的,服用500 mg的类风湿关节炎患者的血浆数据可以说明。氯喹是一种廉价、安全的药物,已经使用了70多年,因此,它可能在临床上也适用于2019-nCoV。

我们的研究结果表明,瑞德西韦和氯喹在体外对2019-nCoV感染有很好的控制作用。由于这些化合物已经在人类患者中使用,并有安全记录,而且证明对许多疾病有效,我们建议应该可用于新型冠状病毒病的人类患者中来进行评估。


  a 用2019-nCoV感染Vero E6细胞,MOI为0.05,用不同剂量的抗病毒药物处理48小时。qRT-PCR检测细胞上清液中病毒产量。用CCK-8法测定这些药物对Velo E6细胞的细胞毒性。图的左、右Y轴分别代表药物的病毒量和细胞毒性的平均抑制百分数。实验分三部分进行。

b 瑞德西韦和氯喹治疗病毒感染后的免疫荧光显微镜观察。病毒感染及药物治疗按上述方法进行。感染后48小时固定感染细胞,以抗蝙蝠SARS相关冠状病毒NP的兔血清为第一抗体,Alexa 488标记的羊抗兔IgG(1:500;Abcam)为第二抗体进行检测。用Hoechst染色法染色细胞核。横杠位置,100 μm。

c d 瑞德西韦和氯喹的加入时间试验。在“全时”处理中,用药物预处理Vero E6细胞1小时,然后添加病毒维持2小时。随后,移除病毒-药物混合物,并用含药物的培养基培养细胞,直到实验结束。在“进入”处理中,病毒附着前将药物添加到细胞中1小时,在感染后2小时,用新鲜培养基替换病毒-药物混合物并保持到实验结束。对于“进入后”实验,药物在感染后2小时添加,并保持至实验结束。所有实验组细胞均感染2019-nCoV,MOI为0.05,感染后14小时用qRT-PCR法测定感染细胞上清液中病毒产量(c),用Western blot法检测感染细胞中NP表达(d)。




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