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由实验中遇到的一个问题所想到的 精选

已有 5950 次阅读 2010-6-20 13:12 |个人分类:经验总结|系统分类:科研笔记|关键词:实验,原位杂交| 实验, 原位杂交

最近做果蝇胚胎的原位杂交五六次了。原位杂交的基本流程是:探针合成及胚胎收集、固定,预杂交,杂交,抗体(碱性磷酸酶标记的抗地高辛)孵育,显色。上次(第五次)在显色的那一步遇到问题。以往的四次,都只要一两个小时显色就充分了,而那一次,用时近二十个小时。
 
开始认为可能是显色前用的碱性磷酸酶缓冲液有问题。在抗体孵育后、显色前,标本需要用PBS清洗三次去除未结合的抗体,再用碱性磷酸酶缓冲液洗三次,为碱性磷酸酶提供一个适合的离子环境和PH值。为了抑制RNA酶,我在许多缓冲液例如PBS中都加入了EDTA,但是,是在做了第一次原位杂交之后才加入的。缓冲液保存于500毫升的玻璃瓶,用的时候,先转移50毫升到大的塑料离心管中。也就是说,第一管50毫升的碱性磷酸酶缓冲液是肯定没加EDTA的,而后面的可能加了。前面几次用的是第一管,上一次用的从500毫升的瓶子里面重新转移到大离心管中的。但是,当我检查装碱性磷酸酶的瓶子的时候,发现上面并没有注明加了EDTA。由于我有时候会忘记做标记,我还是认为,可能是加了EDTA但是没有标记。而EDTA可以抑制碱性磷酸酶的活性的。
 
于是做第六次原位杂交。这一次,我重新配了碱性磷酸酶缓冲液,可以肯定是没加EDTA的了。显色的时候,我只用了一半的标本,但是,显色半个小时候,颜色基本上没有变化!按照这种趋势,肯定又要十几个小时显色才充分,显然,问题不是上次用的缓冲液加了EDTA,而是另有原因。
 
由于我这次用的探针稀释浓度非常之高(1:1000),而且用了非常严格的洗脱条件,所以也有可能是探针完全被洗脱了。但是,还有其它的可能吗?
 
我忽然想到抗体失效的问题。于是去检查了抗体的稀释日期。由于抗体的使用浓度是1:2000,所以我先配了一个1:20的稀释溶液,否则加样太少,无法实现。这个稀释日期是5.21,而前四次都是在6.2之前做的,距离稀释日期少于等于12天,显色没有问题,第五次,是在6.12做的,距离稀释日期已经有22天,今天距离稀释日期已有29天。
 
同时我想到了导师曾经跟我说过,抗体稀释后的保质期在一周左右。因为以前做免疫染色的时候,有些抗体稀释了一个月之后仍然有效,我当时并没有太在意这个问题,而今想起来,确实非常可能是稀释的抗体失效了。
 
于是设计了一个简单的实验来检验这个推测。重新做了一个稀释的抗体,加了显色液于解剖板的三个孔中,然后,第一个孔加入1微升5.21稀释的抗体,第二个加入一微升新稀释的抗体,第三个孔为空白对照,不加抗体。三分钟后,颜色变化非常明显:第二个孔明显比第一个孔颜色要深,而第三个孔基本上不变色。
 
幸好,我只用了一半的标本显色,还留有一半标本。这样,我就不用从头开始,节约了两天时间。于是就把另外一半标本重新用今天稀释的抗体孵育,然后再显色。两个小时后,颜色变化就已经很明显了。
 
从这次失败中,我能学到什么呢?
 
首先,一定要非常清楚试剂的保质期。实验失败,试剂过期是一个常见原因。如果不清楚试剂保质期有多久,就可能用过期的试剂,导致实验失败,浪费时间。不同的试剂保质期是不一样的,酶、抗体等蛋白质制品保质期较短,而且稀释后有效期维持更短。很多实验室,为了节约经费,往往会用已经过了保质期的试剂。很多情况下,这些试剂虽然过期,但是还是有效的。如果实验室有人最近用过而且有效,则可以放心使用。但是,如果不清楚这些试剂是否有效,则使用之前需要设计一个简单的实验来检测。
 
其次,实验用品一定要做好详细的标记,包括:名称(全称或通用的简称)、配置日期,配置者姓名、PH值、配好后是否又加入了某些试剂等等。标有日期,将来才清楚是否过了有效期。这一次,前面我对显色失败的原因分析之所以不对,就是因为我没有严格地做到这一点,所以,即使没有标明加了EDTA,我也不能排除已经加过。
 
实验室里常常有前人留下的配好的试剂。对于这些试剂,使用的时候一定要清楚可能失效了。一般来说,没有标明配制日期而且试剂本身有效期较短且试剂不贵的情况下,应该抛弃。很多试剂,最好是使用自己亲自配制的,否则实验中出了问题难以找出原因。
 
推而广之,除了应该清楚试剂的有效期之外,还应该清楚试剂的其它性质。例如,是否有毒?使用的过程中应该注意些什么?如果不清楚哪些试剂有毒、操作中怎样保护自己,就容易使自己受到有毒物质的侵害。除了毒性之外,还必须清楚试剂的其它注意事项,例如作用的基本原理、配制过程中需要注意哪些问题等等。
 
此外,对于每一次失败,每一个实验中遇到的问题,应该提出至少三种可能的原因。我之所以第一次分析原因的时候没有找到正确的原因,还在于我只提出了一个可能的原因。事实上,引起问题的可能性是多种多样的,只提出一个解释,对的几率较小,如果同时提出多个假设,其中有一个正确的可能性就会大大增加。一开始就提出多个可能,可以在做实验检验的时候同时检测多个因素,这样,就容易通过一次实验找到症结。如果一开始提出一个可能,做实验去检验,发现不对,又提出另外一个可能,再做一次实验,发现还是不对,然后提出第三种可能,做第三次实验才发现原因,效率就会大大降低。



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