A story about Fatty acid (I)

代谢综合征（metabolic syndrome），通常也被称为胰岛素抗性综合征（insulin resistance syndrome, Syndrome X），是临床上常见的失调病症，表现为血液中胰岛素水平较高，常常伴随其他调节紊乱，比如内脏性肥胖（visceralobesity）、高血脂（hyperlipidemia）、血脂异常（dyslipidemia）、高血糖（hyperglycemia）、高血压（hypertension），有时也伴有高尿酸症（hyperuricemia）和肾功能异常（renaldysfunction）。[1]

脂肪酸的代谢可能是导致代谢综合征的主要原因，乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase,ACC）是脂肪合成过程中的限速酶，依赖于ATP提供的能量将乙酰辅酶A羧化后催化产生的丙二酰辅酶A（Manoly-CoA）通过反馈抑制肉毒碱棕榈酰转移酶1（carnitine palmitoyltransferaseI 1, CPT-1）的活性，进而抑制线粒体内对脂肪酸的氧化过程，如此便会调节碳水化合物和脂肪酸在肝脏、肌肉和脂肪组织内利用转换的开关，也会影响胰腺分泌胰岛素。ACC主要受饮食、激素、其他生理反应包括柠檬酸盐（citrate）的正反馈激活（feed-forwardactivation）、长链脂肪酸的负反馈抑制（feedback inhibition）、AMP活化的蛋白激酶（AMPK）的磷酸化调节和失活、基因水平的调控等等。

ACC在机体内存在两种组织特异性的异构体或同工酶（isozyme），ACC1（细胞质内合成脂肪组织同工酶，常见于肝脏和脂肪组织，实验常用HepG2细胞）和ACC2（线粒体相关的氧化组织同工酶,常见于肝脏、心肌和骨骼肌，实验常用C2C12 cell）。ACC在结构上可分为生物素羧化酶（biotin carboxylase, BC）和羧基转移酶（carboxyltransferase,CT）两部分。简单来说，ACC1和ACC2都是将糖、蛋白或脂肪等碳水化合物转化过来的乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A。在肝脏中，同时发生脂肪酸的氧化和合成，细胞质中经ACC1转化的丙二酰辅酶A会被用于合成长链脂肪酸，或者转变为甘油三酯（triglycerides）、磷脂（phospholipids）或者以高甘油酯蛋白（比如超低密度脂蛋白VLDL）的形式释放出去，储存在脂肪组织等；ACC2在线粒体表面转化的丙二酰辅酶A是CPT-1的变构抑制剂，阻止脂肪酸进入线粒体进行β-氧化过程（间接的看，ACC2也是促进了脂肪酸的合成）。餐后由于摄取大量的碳水化合物，体内的ACC1和ACC2会将大量的乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，直接促进脂肪的合成，抑制脂肪的氧化，表现为净储存脂肪；若是在饥饿或运动的情况下，没有足够的乙酰辅酶A，脂肪的氧化将会高于合成，此时表现的即是净消耗脂肪。[2]

Acetyl-coenzyme-A carboxylase (ACC) has critical rolesin fatty acid metabolism.[2]

Wakil等人在2001年报道了ACC2基因敲除小鼠体内的脂肪合成情况，结果表明敲除ACC2基因的小鼠骨骼肌和心肌内Manoly-CoA的含量明显下降，同时加快了脂肪酸的氧化过程，降低肝脏内和机体整体的脂肪酸含量，同时血液内的自由脂肪酸和血糖的含量也比野生型的要低，然而并不影响小鼠的生存率和寿命。然而肝脏内的Manoly-CoA并未受到明显的影响，根据前人的工作可以推测肝脏内ACC1所产生大量的Manoly-CoA会给予某种补偿效应。[3]这些信息不难给人们一个想法：通过抑制ACC的活性来缓解代谢综合征。Pfizer早在1996年便开始寻找这类ACC特异的、同工酶非选择性的抑制剂，希望获得同时抑制ACC1和ACC2的小分子化合物。

Relative amounts of malonyl-CoAin wild-type (Þlled symbol) and Acc22/2 mutant (open symbol) mice.[3]

现在也有许多结果显示脂肪酸的代谢与非酒精类脂肪肝（NAFLD）、癌细胞代谢、肿瘤发生等过程相关。[4, 5]Nimbus在几个月前与Gilead完成了一个关于NASH药物的交易就是关注在ACC这个药物靶点，部分结果与年初已发表在PNAS期刊。[6]看到Pharmaron（Biology）的名字列在作者名单中，简单介绍一下这项创新性的工作也好，我也很想知道这件成功的案例背后有哪些秘密。

忽然间看到了H. James Harwood Jr.的名字，因为接连看了几篇关于ACC的文章，他要么是一作，要么是通讯。再一看，原来他负责了Pfizer全球部心血管类和代谢类疾病的R&D，直接领导了早期的ACC抑制剂的研发（原来和我们开电话会议的就是这位大佬！OMG，这么长时间竟然没发现）。后来他来到Nimbus，也就不难理解为何有如此之快的进展，这不是踩在巨人的肩膀，这不是偶热，这里面已经有将近十年的蛰伏。

他们做了非常充分的准备和分析工作。早期的研究已经筛选了许多ACC同工酶非选择性的小分子抑制剂，他们大部分是结合ACC的CT结构域，在体外和体内的结果都显示这些药物的高效性，而且在临床上确实明显地看到这些化合物对脂肪酸合成的抑制和对氧化的促进作用。然而，靶向这个结构域的药物需要有较高的疏水性，这样导致许多化合物在药理性征不是很好。换个思路，ACC的BC结构域中含有对功能至关重要的二聚化位点和AMPK磷酸化位点，而且活性区域偏亲水性，可以用于作为筛选变构抑制剂的靶点。于是，人们开始了基于结构设计药物的方法，先模拟筛选系列可能影响蛋白间相互作用的小分子，再通过HTS筛选。就这样，开展了为期约6年的征程。

对于一个start-up的公司，他们没有自己的化合物库。借用Gilead的模拟分析平台，参考Soraphen A和ACC共结晶结构，起初设计并合成了约250个很有希望的化合物（这就是CADD部门的强大之处吧，既节省成本又高效），接下来就是利用生物所搭建的酶学试验、细胞实验开始评价药物的性能。发现数个非常potent的抑制剂，其中有一个小分子ND-022结合在ACC的二聚化位点处，竞争性结合试验与晶体结构解析都看到了这个结果。后续开始了系列的优化过程，依据晶体结构展示的结合位置，优化了小分子与关键氨基酸之间的非公价结合作用、提升化合物取代高能量水分子的性能，由此以来，人们发现了一个drug-like的药物——ND-630。

上面体外、细胞水平的ACC抑制剂筛选的工作就是在Pharmaron完成的，我想化合物优化和合成的工作也是在这里完成的吧。这个化合物对ACC拥有很高的选择性，这和作用位点很有关系，因为这个位点在在其他羧化酶中并非常见、也不保守；630是水溶性较好的化合物（溶解度为594 uM）、在人和大鼠内的PPB分别为98.5%和98.6%、大鼠中的t_1/2为4.5h，F%=37%，CL=33mL/min/kg，Vdss=1.9L/kg，口服后血浆中达到最大剂量需要0.25h，AUC_(0-∞)=1932ng•h•mL^-1，口服后血浆中最高浓度Cmax-plasm=6.0uM，肝脏中最高浓度Cmax-liver=81uM，肝脏、血浆和四头肌肉的暴露率比为135:10:1，不通过血脑屏障（BBB）。除去这些参数以外，还有最大耐受剂量（maximum tolerated dose）、体内毒性（toxicities）、体内疗效等等。现在我还无法结合实际评价这些参数，只是有种大概的感觉，最主要的评价方向是毒性和疗效。上次在课上听到器官特异性的毒性评价，现在还是苗头，日后应该是趋势。考虑到药物的作用靶点、机理、位置等，一些药物并非需要完全合格的PK数据，就是这些少数的药物，容易被人们忽视。前不久听到Gilead的一个治疗HBV的药物在临床上获得很大的成功，而该药物t1/2仅有3min、在血浆中的暴露量非常低，可是毒性非常低、疗效非常好，究其原因，一部分是由于在肝脏中的特异分布，当然也与靶点的选择有关。其实早在1980s人们就提出了这一概念，这么多年来没有太多的进展，是否与器官的复杂性相关？人们对这个领域了解甚是匮乏，才让人无处下手，好比饶毅教授曾经介绍的睡眠机理，这篇领域已经接近空白许多年了。

回到ND-630，分析他是否抑制靶点比较容易，可是在机体的水平分析她是否对某种疾病有效是比较难的。为了减少在人体试验（也就是临床）的失败几率，人们在临床前使尽浑身解数，在体外、动物体内反复验证，检测靶点下游的产物合成情况、毒副作用、急性试验与慢性毒性、还有在人源化的动物疾病模型测试，尽量接近人类的身体条件等等。由一个分子水平上的靶点，到治疗机体水平的疾病，有时是有点不可思议，这种思路与中医是有明显区别的，暂不分析西医与中医哪一个更占据优势，若是二者的理论能柔和一些，会有哪些新鲜的东西出来？是否用药的方式？评价的机制？药物研发的整体思路都会有创新呢？不知何时才能涌现出一位敢于尝试的大家，或是一件成功的案例，改变人们在药物研发中的观念。

看着文章的介绍，不禁让人重新审视这类文章背后的意义：曾经发表文章是为了获得答辩的资格，如今看到制药公司发表的文章，一部分是临床或研发实验失败后总结的结果，一部分是成功进入临床或市场后展示的分子机制与数据，重在救人，相当大的一部分是在创新道路上的探索。虽说仅仅罗列的一部分人在作者名单中，背后参与的团队是非常之庞大的，任何一个实验都由成队的人们共同完成。是的，这个时候我们不能说具体某个人参与了文章内部的工作，而是一个或数个团队这样整体的称呼。

谈到ACC抑制剂的筛选，貌似勾起了我对脂肪酸代谢领域的兴趣，我一向不想喜欢酶学的理论和实验，可是现在的工作内容和酶却无法分割；我一向不喜欢脂肪酸相关内容，因为曾经的生化仅仅得了60分，因为自未曾记得三羧酸循环，因为自己研究生训练都是围绕病毒，未曾关注过脂肪酸，因为自己曾经的眼界狭窄，未能接触眼外的世界；我一向不喜欢脂肪酸，最主要是因为我不喜欢吃肥肉，天生的排斥。经过大半年的练习，我好像可以很快的进入一个于我而言全新的领域，即使曾经对她们一无所知，我可以查阅，我可以请教，我可以学习。因为看到了太多的不知道，所以也就对知道不以为然了，不论你曾经获得多少知识，能获得多少新技能才是最吸引人的地方。

脂肪酸代谢过程具体如何？医疗领域中有哪些靶点？主流的相关药物和疾病有哪些？如何研制靶向此处的药物?有哪些公司角逐在这篇领域？期待后面的新发现、新问题。

TJ  泰河园

2016年8月13日  星期六

References

1.  Harwood, H.J., Jr., etal., Isozyme-nonselective N-substitutedbipiperidylcarboxamide acetyl-CoA carboxylase inhibitors reduce tissuemalonyl-CoA concentrations, inhibit fatty acid synthesis, and increase fattyacid oxidation in cultured cells and in experimental animals. J Biol Chem,2003. 278(39): p. 37099-111.

2.  Tong, L. andH.J. Harwood, Jr., Acetyl-coenzyme Acarboxylases: versatile targets for drug discovery. J Cell Biochem, 2006. 99(6): p. 1476-88.

3.  Abuelheiga,L., et al., Continuous fatty acidoxidation and reduced fat storage in mice lacking acetyl-CoA carboxylase 2.Science, 2001. 291(5513): p. 2613-2616.

4.  Baenke, F.,et al., Hooked on fat: the role of lipidsynthesis in cancer metabolism and tumour development. Dis Model Mech,2013. 6(6): p. 1353-63.

5.  Mounier, C.,L. Bouraoui, and E. Rassart, Lipogenesisin cancer progression (review). Int J Oncol, 2014. 45(2): p. 485-92.

6.  Harriman, G., et al., Acetyl-CoAcarboxylase inhibition by ND-630 reduces hepatic steatosis, improves insulinsensitivity, and modulates dyslipidemia in rats. Proc Natl Acad Sci U S A,2016. 113(13): p. E1796-805.