在前面两讲中，我们对乙烯受体家族的“发家史”以及受体“五兄弟”复杂的关系进行了详细的介绍，相信大家已经认识到了受体在乙烯信号转导通路中的决定性作用。接下来，人们很自然地就会想到，既然乙烯受体这么重要，它们是受什么调控呢？另外，受体和乙烯结合后，是如何一步一步引起特异的“三重反应”的呢？今天我们先讲第一个问题，聊一聊乙烯受体ETR1的那些不太为人们熟知的故事。

2006年，Caren Chang课题组在PNAS上发表了一篇题为REVERSION-TO-ETHYLENE SENSITIVITY1, a conserved gene that regulates ethylene receptor function in Arabidopsis的文章。他们以拟南芥etr1-2（显性乙烯不敏感）突变体为材料，通过人工诱变的方法，筛选etr1-2的抑制子（supressor）。其中，REVERSION-TO-ETHYLENE SENSITIVITY1（RTE1）基因突变后，可抑制etr1-2的乙烯不敏感表型：etr1-2 rte1-1双突的乙烯反应和野生型相似，具有正常的三重反应。并且，rte1突变后，etr1-2的乙烯不敏感表型在多个生长时期都能被抑制，说明etr1-2引起的乙烯不敏感需要RTE1，并且RTE1应该在乙烯信号转导早期发挥作用。另外，rte1-2etr1-7（都为loss of function）双突的乙烯反应表型和单突rte1-2以及etr1-7类似，都表现出部分的乙烯过敏感表型。

rte1突变抑制etr1-2的乙烯不敏感表型（Resnick等，2006）

etr1-1是ETR1基因的另一个gain of function的乙烯不敏感突变体。有意思的是，rte1-2并不能抑制etr1-1的乙烯不敏感表型：etr1-1rte1-2双突仍然对乙烯不敏感。同时，对于其他四个乙烯受体gain of function突变体的乙烯不敏感表型，rte1也一概不能抑制。以上结果说明，RTE1可能只能特异地作用于受体ETR1。

通过图位克隆，确定RTE1基因为二号染色体上的At2g26070。测序发现，rte1-1编码区发生一个G-A错义突变， rte1-2 3‘端缺失一个碱基，rte1-3提前终止。RTE1编码250个氨基酸，大小25kDa，是一个以前从未报道过的在多种生物中都高度保守的蛋白家族。RTE1在拟南芥大多数组织和器官中都有表达，但在种子和生长后期的角果中优势表达，外源乙烯处理可促进RTE1基因mRNA的累积。另外，过表达RTE1可导致转基因拟南芥乙烯钝感，说明RTE1是乙烯信号负调控因子。

RTE1的图位克隆及功能验证（Resnick等，2006）

2007年，中科院上海植生所文啟光课题组在Plant Physiology上发表文章RTE1 Is a Golgi-Associated and ETR1-Dependent Negative Regulator of Ethylene Responses，对RTE1和ETR1的相互依赖关系进行了详细报道。在前面我们刚提到，在拟南芥中过表达RTE1可导致乙烯钝感。将etr1-7（Loss of function）导入RTE1过表达植株中，出现正常的三重反应，而其他乙烯受体loss of function突变并不能抑制RTE过表达植株的乙烯不敏感表型。以上结果说明，RTE1行使乙烯信号转导的功能，特异地依赖受体ETR1。

RTE1特异地依赖ETR1（Zhou等，2007）

在《乙烯受体家族的“爱恨情仇”》中我们提到过，ETR1有四个保守的结构域：Ethylene binding domain、GAF domain、kinase domain以及receiver domain。那么ETR1的哪些结构域是RTE1行使功能所必须的呢？研究发现，ETR1的N端（1-349，包括Ethylene binding domain和GAF domain）就可以恢复gRTE1 etr1-7 的乙烯不敏感表型。另外，etr1-2 gain of function的乙烯不敏感表型也依赖于RTE1，那么RTE1的什么结构域又是etr1-2 所必须的呢？将不同物种的RTE1-like基因同源比对后发现，其N端相似性较低（不保守）。将RTE1的N端删除（分别删除25和49个氨基酸），并在etr1-2 rte1-2中过表达。和野生型RTE1相似，N端删除后的RTE1仍可使转基因材料表现出乙烯不敏感表型，说明RTE1的N端不是etr1-2行使功能所必需的。

ETR1和RTE1的相互依赖关系（Zhou等，2007）

为了进一步研究RTE1蛋白的亚细胞定位，构建GFP-RTE1融合蛋白，转化至etr1-2rte1-2双突中，观察能否恢复双突的乙烯反应，行使正常的功能。值得一提的是，融合蛋白能行使正常的功能，是做亚细胞定位的前提。否则，作出的亚细胞定位有可能是错误的。此处非常有意思的一点是，将GFP连接到RTE1的C端，不能恢复双突的乙烯反应，而只有将GFP连到N端，才能正常行使功能。进一步利用洋葱表皮细胞瞬时转化系统，发现GFP-RTE1蛋白定位在高尔基体上。从此处我们可以吸取一些经验，tag并不是万能的，它们毕竟是人为添加上去的一段东西，可能会对我们的目的蛋白造成各种影响。所以如果我们要在蛋白后面添加tag时，要小心，一定要先进行功能验证。另外，为了减少时间成本，在构建载体时，可以考虑连接不同的tag，并且在目的蛋白的N端和C端分别连接。

GFP-RTE1定位在高尔基体上（Zhou等，2007）

2008年，Caren Chang课题组在The Plant Journal 上发表文章Subcellular co-localization of Arabidopsis RTE1 and ETR1 supports a regulatory role for RTE1 in ETR1 ethylene signaling，对RTE1和ETR1的亚细胞定位和功能进行了更加细致深入的研究。对RTE1启动子融合GUS的稳定转基因拟南芥观察后发现，RTE1的表达模式和ETR1有很强的关联性，并且有部分重叠。将RFP-RTE1融合蛋白转化至拟南芥中发现，RTE1蛋白主要定位在高尔基体上，部分定位在内质网上，并且乙烯处理不改变蛋白定位。

RFP-RTE1定位在内质网和高尔基体上（Dong等，2008）

在《乙烯信号开山之作：受体ETR1的鉴定》中我们讲过，在前期的研究中发现ETR1定位在内质网上。在本研究中，Dong等通过免疫组织化学的方法对ETR1的蛋白定位重新进行了研究，发现和RTE1相似，ETR1也是主要定位在高尔基体上，部分定位在内质网上。由于之前使用的技术本身的缺陷，并不能将高尔基体和内质网完全分开，因此没有发现ETR1的高尔基体定位。在此基础上进一步发现，ETR1和RTE1有共定位。由此可见，技术手段的精确性对科学结论准确性的影响有多大。

ETR1定位在内质网和高尔基体上，并与RTE1共定位（Dong等，2008）

讲到这里，我们已经对ETR1和RTE1之间复杂的关系有了比较详细的了解。但是，它们之间这种复杂关系的分子机制到底是什么呢？2008年，Caren Chang实验室在The Plant Journal发表文章Involvement of RTE1 in conformational changes promoting ETR1 ethylene receptor signaling in Arabidopsis，提出了RTE1对ETR1功能影响可能的分子机制。研究人员使用遗传学手段，研究了rte1-2（功能缺失）对11个etr1突变体功能的影响。这11个etr1突变位点分布于3个乙烯结合结构域上，都引起乙烯不敏感/钝感的表型。将rte1-2分别导入11个etr1突变体中，双突分为两种类型：一种乙烯反应得到部分恢复；另一种乙烯反应没有任何改变。对乙烯反应得到恢复的etr1突变体统计后发现，rte1-2既可以抑制强的etr1等位突变，又可以抑制弱的etr1等位突变，并且跟它们是否能结合乙烯以及突变位置位于哪一个跨膜结构域无关。有意思的是，对于其他的一些可引起相同的乙烯结合能力改变，并导致相同的乙烯反应表型的etr1等位突变，rte1-2其表型却没有影响。由此推测，不同的etr1等位突变可能会导致ETR1乙烯结合结构域构象发生不同的改变，而RTE1可能通过影响ETR1的构象发挥作用。

rte1-2对etr1功能获得突变体的影响（Resnick等，2008）

ETR1和RTE1的共定位以及它们之间的相互依赖关系，暗示着这两个蛋白有互作的可能性。那么，生物体内的实际情况是什么样呢？2010年，Caren Chang实验室发表在Journal of Biological Chemistry上的题为 Molecular association of the Arabidopsis ETR1 ethylene receptor and a regulator of ethylene signaling的文章中，科研人员综合使用BiFC以及Co-IP技术，分别从体内和体外两方面证明了ETR1和RTE1的互作，进一步揭示了两者之间相互影响的分子机制。

ETR1和RTE1互作（Dong等，2010）

为了进一步揭示RTE1调控ETR1的分子机制， Caren Chang课题组对RTE1的互作蛋白进行了筛选和研究，相关成果以Association of cytochrome b5 with ETR 1 ethylene receptor signaling through RTE 1 in Arabidopsis为题，于2014年发表在The Plant Journal上。研究人员通过酵母双杂筛选RTE1的互作蛋白，筛选到一个定位在内质网的cytochrome b5（Cb5）蛋白。Cb5s是一类小分子血红素蛋白，在真核生物中具有转移电子的功能，但是它们在植物中的功能还不清楚。通过BiFC发现，定位于内质网膜上的4个Cb5 isoform（AtCb5-B，C，D，E）都可以和RTE1互作。atcb5突变体的乙烯反应表型和rte1相似，并且可以部分抑制etr1-2的乙烯不敏感表型。同时，对独立于RTE1的乙烯受体显性突变体也不具有抑制作用。atcb5-b，-c，-d单突的乙烯反应和野生型相似，但双突对乙烯过敏感；和RTE1过表达植株相似，AtCb5-D过表达导致乙烯敏感性降低。遗传分析表明，Cb5作用于RTE1的上游。以上结果说明，Cb5和RTE1相互合作，共同促进ETR1介导的抑制乙烯信号转导的作用。

Cb5和RTE1互作，并位于RTE1下游（Chang等，2014）

Caren Chang课题组通过近十年的努力， 终于把RTE1和ETR1之间的那些事儿理清了一些头绪。不过，如果仔细追究的话，它们之间仍有许多未解之谜等着人们去探索。由此想到了我们上学时用的课本，上面的每一个结论都是人类集体智慧的结晶。每一句话的背后，都隐藏着好几辈科学家呕心沥血的探索和追寻。正是这些先辈们的努力，才促使今天高度发达的科技和丰富的物质。当我们每天享受着科技发展带来的成果时，不要忘了那些最可爱的科研工作者们。

 【参考文献】

Resnick, J. S., Wen, C. K., Shockey, J. A., & Chang, C. (2006). REVERSION-TO-ETHYLENE SENSITIVITY1, a conserved gene that regulates ethylene receptor function in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(20), 7917-7922.

Zhou, X., Liu, Q., Xie, F., & Wen, C. K. (2007). RTE1 is a Golgi-associated and ETR1-dependent negative regulator of ethylene responses. Plant Physiology, 145(1), 75-86.

Dong, C. H., Rivarola, M., Resnick, J. S., Maggin, B. D., & Chang, C. (2008). Subcellular co‐localization of Arabidopsis RTE1 and ETR1 supports a regulatory role for RTE1 in ETR1 ethylene signaling. The Plant Journal, 53(2), 275-286.

Resnick, J. S., Rivarola, M., & Chang, C. (2008). Involvement of RTE1 in conformational changes promoting ETR1 ethylene receptor signaling in Arabidopsis. The Plant Journal, 56(3), 423-431.

Dong, C. H., Jang, M., Scharein, B., Malach, A., Rivarola, M., Liesch, J., ... & Chang, C. (2010). Molecular association of the Arabidopsis ETR1 ethylene receptor and a regulator of ethylene signaling, RTE1. Journal of Biological Chemistry, jbc-M110.

Chang, J., Clay, J. M., & Chang, C. (2014). Association of cytochrome b5 with ETR 1 ethylene receptor signaling through RTE 1 in A rabidopsis. The Plant Journal, 77(4), 558-567.

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