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【每周文献】Pit激活OsRac1引起植物免疫 Cell Host & Microbe-2010

已有 548 次阅读 2019-9-10 23:05 |个人分类:科研随笔|系统分类:科研笔记

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背景介绍

OsRac1是一种小GTPase,和GDP结合处于非活性状态,和GTP结合处于激活状态。前期研究表明,OsRac1可以诱导水稻对多种病原菌侵染产生免疫。说明OsRac1在植物免疫方面发挥重要作用,但是具体的分子机制仍不清楚。


科学问题

OsRac1增加水稻抗病性的分子机制是什么?

解决方法:筛选OsRac1的互作蛋白。


主要结论

1.OsRac1NLR家族蛋白互作

使用亲和柱层析法(affinity column chromatography)筛选OsRac1的互作分子,鉴定到了5NLR蛋白。由于NLR蛋白难于在体内表达,因此使用体外翻译的方法表达NLR蛋白后,进行Pull-down验证互作。发现OsRac1可以和NLR1在体内互作。domain mapping发现,OsRac1NLR1NB-ARC domain互作。

由于这5NLR的功能还没有被研究,它们是否是R蛋白还不清楚。因此,作者找了5个功能已知的R蛋白(Pit, Pib, Pi9, Xa1Pi-ta)进行了互作验证,发现OsRac1Pit, Pib, Pi9, Xa1NB-ARC domain互作。由于OsRac1Pit的亲和性最强,因此以对两个蛋白进行了后续研究。

2.PitOsRac1的定位和互作

亚细胞定位发现,Pit主要定位在细胞膜上,少部分定位在细胞质中。OsRac1也定位在细胞膜上。OsRac1Pit共定位。BiFC发现,OsRac1Pit在细胞膜上发生互作,并通过Co-IP(烟草瞬时转化)对互作进行了验证。

3.OsRac1参与Pit介导的植物免疫

为了检测OsRac1Pit生物学功能之间的关系,在携带有Pit基因的水稻中沉默OsRac1的表达,转基因植株的抗病性降低。

4.Pit激活HRROS的产生

Pit MHD motifD458V突变,瞬时转化烟草导致HR反应和ROS的积累,而P-loopK203R突变会抑制D458V突变导致的细胞坏死。

问题Pit激活HRROS的产生和OsRac1有什么关系?

5.Pit激活HRROS的产生依赖于OsRac1

Pit(D458V)DN-OsRac1(活性降低)共表达,会降低Pit激活HR和诱导ROS的产生,说明Pit激活HRROS的产生依赖于OsRac1

问题:分子机制是什么?

线索

1.PitOsRac1互作,激活状态的PitOsRac1的亲和性有什么区别?

2.OsRac1ATP结合时为活性状态,PitOsRac1的激活有什么影响?

6.激活状态的PitOsRac1亲和性增强

刚开始试图在烟草叶片中瞬时共表达PitOsRac1,以检测它们的亲和性,但是这两个蛋白共表达会导致HR反应,影响蛋白的产生。因此,作者在人成纤维细胞中进行外源共表达,再通过Co-IP检测蛋白亲和性,发现Pit D458VOsRac1的亲和性增强,而Pit K203RD458VOsRac1的亲和性降低。说明激活状态的PitOsRac1亲和性增强,并且Pit结合ATP的活性是和OsRac1互作必需的。

7.Pit可以激活OsRac1

使用intramolecular FRET system (Raichu)证明,Pit可以激活OsRac1


技术方法

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Take Home Message

1.R蛋白难表达,可在体外翻译,纯化出蛋白后再进行生化试验。

2.本文中R蛋白自激活突变体在植物中表达会发生HR反应,为了解决这种影响,作者在人类成纤维细胞中表达,再进行后续的亲和实验,这是一种可以借鉴的方法。但是,植物蛋白在动物中表达,不知道结果可信度有多高。

 




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