亚马逊雨林向农业的转变导致土壤细菌群落的生物均质化

Conversion of the Amazon rainforest to agriculture results in biotic homogenization of soil bacterial communities

译者：刘海燕 石河子大学

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

杂志：PNAS

第一作者：Jorge L. M. Rodriguesa

通讯作者：Brendan J. M. Bohannan (bohannan@uoregon.edu) 和 James M. Tiedje (tiedjej@msu.edu)

1. 德克萨斯大学阿灵顿分校生物系，TX 76019;
2. 圣保罗大学海洋学研究所，巴西圣保罗，05508-120;
3. 俄勒冈大学尤金分校生态与进化研究所，97403;
4. 马萨诸塞大学微生物学系，Amherst, MA 01003;
5. 密歇根州立大学微生物生态系，东兰辛，密歇根州48824

摘要

亚马逊雨林是地球上最大的植物和动物多样性的资源库，它受到了特别大的土地利用变化冲击，主要是牛牧场。这种转化对生物多样性产生了强烈的负面影响，减少了动植物物种的数量，使群落趋于均一。我们在此报道，微生物多样性对亚马逊雨林的转换也有很强的反应，但与动植物的方式不同。土壤细菌的局部分类和系统发育多样性在转化后增加，但群落在空间上变得更加相似。这种同质化是由有限范围(地方性)的森林土壤细菌的丧失引起的，并导致了多样性的净丧失。本研究表明微生物群落在人类活动下均质化。鉴于土壤微生物是陆地生态系统中生物多样性的主体，并且与生态系统功能密切相关，我们认为在评估热带雨林土地利用变化的影响时，应该考虑微生物生物多样性的损失。

关键词

森林砍伐 | 微生物 | 群落相似性 | 空间尺度 | 距离衰减

研究背景

热带雨林仅占地球陆地面积的7%，但它们却支撑着所有已知动植物物种的60%以上(1)。在世界范围内，热带雨林正面临着多种人为威胁，如污染、气候变化和森林砍伐(2)。亚马逊雨林是世界上面积最大的赤道森林，是动植物物种的最大资源库，估计有四分之一的陆地物种生活在这里(1)。主要由于农业的大面积采伐正严重威胁着热带雨林(3,4)。这种向农业转化的生态系统对动植物生物多样性有很大的影响(3,4)，但微生物的反应却知之甚少。总的来说，几乎不知道森林向农业转化对土壤微生物多样性的影响(5)。由于土壤微生物，尤其是细菌，是陆地生态系统中生物多样性的主要来源，并且与生态系统功能密切相关，包括碳固定和元素循环(6)，这种知识的缺乏引起了同行极大的关注(6)。

先前的研究表明，在亚马逊雨林中，微生物群落介导的生物地球化学循环，包括氮循环和甲烷的产生，被生态系统转换改变了(7-13)，而在亚马逊雨林和牧场之间，土壤中的细菌群落组成可能不同(14-16)。然而，迄今为止，只有一项研究试图确定亚马逊地区细菌多样性对生态系统转换的影响(14)。

本研究发现牧场的细菌多样性高于雨林土壤。作者认为亚马逊雨林的生态系统转换并没有“耗尽细菌多样性”(14)。这一观察结果与先前报道的植物和动物多样性有根本不同，后者在地上和地下都趋于减少。这句话的暗指结果是，在评估大规模雨林转化为农业的影响时，不需要考虑细菌的生物多样性。然而，此研究的采样深度和范围有限，只关注局部多样性(惠塔克意义上的alpha多样性，参考文献18)。因此，它可能低估了在更大的地理尺度上发生的多样性变化。我们的研究旨在克服这些局限性。

结果

我们的研究地点是巴西朗多尼亚的Fazenda Nova Vida，这是亚马逊地区最深入研究的生态系统转换地点，有大量关于该地点生态系统对转换影响的文献支持(7-13)。土壤采样沿着10公里的原始森林和附近牧场(1987年建立)。我们使用了一种空间嵌套的采样方案，结果是每个地点收集36个土壤样品，样品间距离从厘米到几十公里不等(图S1)。使用细菌16S rRNA基因测序对每个土壤样品的细菌群落进行鉴定(15,19)。序列聚类的阈值分别为95%和97%(19)，被聚类为可操作分类单位(OTUs)。利用分类学和系统发育学方法计算群落多样性和相似性。分类学相似度计算为继承OTUs的聚类阈值，系统发育相似度计算为两个群落间共享系统发育分支长度的比例。

我们估计样本内(alpha)多样性(18)是来自给定土地使用类型(森林或牧场)的所有土壤样品的平均丰度。beta多样性(18)被估计为转变和变异(20)。通过确定每个土地利用类型的地理距离与群体相似性之间关系的斜率(20,21)，变异(估计为群落相似性随距离的衰减)为每一种土地利用类型(20)的平均两两群落相似度的变化。

图1. 草地和森林土壤细菌群落组成。

A. 门水平的丰度组成； B. NMDS绘制物种组成的Bray-Curtis距离；C. NMDS绘制 Unifrac距离。

我们观察到牧草土壤细菌群落在分类学和系统发育组成上都与森林土壤有显著差异[相似度分析(ANOSIM): R = 0.555，分类 P < 0.001, R = 0.442，系统发育 P < 0.001 (图1)。这些差异在门水平(图1a)和OTU水平(图1bdc)都很明显。对转化反应的比例下降最大的是酸菌门，从森林中发现的平均OTUs的21.1%下降到草地中的13.4%，其次是Nitrospirae和Gemmatimonadetes。对转化反应的比例增加最大的是厚壁菌门，从森林样品的2.2%增加到牧场的12.6%，其次是Actinobacteria 和 Chloroflexi。森林和草地土壤的环境特征也不同; 例如，森林土壤的pH值明显低于草地土壤，总碳含量明显低于草地土壤，铝浓度明显高于草地土壤(表S1)。在非度量多维坐标图上进行12个土壤变量的环境拟合时(附图1，S2)，森林微生物群落的pH值较低，铝浓度和饱和浓度均增加，而牧场群落的碳、氮和镁浓度增加。

牧草土壤细菌群落的alpha多样性显著高于森林土壤(图2)。这个结果既适用于分类丰富(t =−3.63,P = 0.001,df = 1,64)和系统发育多样性(t =−5.98,P < 0.001,df = 1,64)。相比之下，beta多样性在牧草土壤中显著降低:细菌群落在组成上显著相似，在空间上的周转率显著降低。这一结果适用于分类和系统发育相似度测度(分类:t = 14.3, P < 0.001, df = 1,434;系统发育:t = 6.62,P < 0.001, df = 1,434;(协方差分析:F=32.0,P<0.001;系统发育F = 49.8, P < 0.001;图4)。

图2. 本地多样性对生态系统转变的响应。

图3. 生态转换下群体相似度的响应。

图4. 群落更新对生态系统转换的响应

讨论

我们观察到的生态系统转换后alpha和beta多样性的差异增加在亚马逊地区的动植物中并不常见，转换通常导致两者的减少(3)。然而，总体而言，alpha多样性并不总是与beta多样性联系在一起(22)，有报道称植物和动物群落对人为干扰做出反应，alpha多样性增加，beta多样性减少(23,24)。这样的系统往往具有相对较低的生产率，在生态系统转换后生产率会提高(24)。我们的地点与观察结果一致;尽管地上初级生产力较高，地下初级生产力较低，且在牧草建立后显著增加(16,25)。这一效应对地下微生物的生产力(定义为微生物生物量的周转)也适用。这种开始生产力的差异可能解释了为什么细菌对生态系统转换的反应不同于植物和动物。结果表明，林间牧草转化对细菌群落组成有显著影响。培养的酸菌门物种是已知的少营养菌，对碳和pH值的增加呈负向反应(26)，这可以解释转换后从该门检测到的序列比例的强烈下降。代表厚壁菌门的大多数成员对干燥和极端环境变化有显著的抵抗能力(27)。已知这些微生物在碳含量高、土壤表面温度全天变化(如我们研究中取的牧场)的环境中生长旺盛，这可能解释了转换后从该门检测到的序列比例大幅增加的原因。

我们的结果的另一个含义是，生物均质化可以抵消由于生态系统转换而增加的局部多样性，从而导致多样性的净损失。有证据表明，这种多样性损失正在我们的系统中发生。在森林中，随着采样点的增加，分类单元的积累速度比牧场中更快。结果是，在相对较低的抽样水平上，森林的平均分类群似乎比牧场少，但随着抽样数据量的增加，森林最终在分类丰富度上超过牧场。我们在所有样本上观察到的差异可能代表了生态系统转换造成的多样性损失的最小值，因为累积曲线还没有接近渐近线。为了揭示多样性的真正损失，需要更广泛的抽样。

然而，鉴于我们使用的分类单元的定义非常广泛(即，即使是这个最小的差异也代表了生态系统转换后大量遗传变异的损失。

这种多样性丧失的长期影响尚不清楚。 特别是，我们所观察到的多样性变化在农业废弃后是否可以逆转，目前尚不清楚。尽管亚马逊森林的植物多样性通常比没有转换历史的森林低(30)，但人们观察到亚马逊森林已被转换为牧场，随后被遗弃，以重建森林。细菌多样性是否会从生态系统转换中完全恢复，部分取决于因转换而丧失的分类单元是否真的在当地灭绝，或者它们是否存在于牧场，但数量如此之少，以至于在我们的研究中无法检测到。然而，这种抽样并不是详尽的(尽管，应该指出的是，大多数关于亚马逊地区植物多样性的研究也是如此)。无论如何，我们观察到的数据表明，随着生态系统的转换，森林特有植物的丰度和它们所具有的特征显著降低，以及这些分类单元的显著同质化。

结论

至少在过去40年里，人们一直非常关注将亚马逊雨林转变为农业系统将导致动植物多样性的丧失(22)。我们已经证明，微生物的多样性也会受到这种环境变化的影响。此外，我们观察到的特定反应——环境变化后alpha多样性的增加和beta多样性的减少——被认为是未来生物多样性丧失的“早期预警信号”(23)。微生物多样性与生态系统功能的关系尚不明确(31)，也没有明确的植物或动物多样性(例如，参考文献32)。然而，由于微生物在许多重要的生态系统功能中扮演着分解者的角色(6)在生态系统转换过程中，微生物多样性的丧失应该引起关注。

材料和方法

取样地点

我们的研究是在亚马逊雨林微生物天文台(ARMO)网站,成立于2009年,它被选为一个模型场地，代表目前亚马逊地区正在进行的大规模农业开发。该场地位于朗多尼亚州，是巴西亚马逊地区森林损失比例最高的州(28.5%)。 这一农业前沿的普遍做法是有选择地砍伐林木，然后砍伐和焚烧剩余的植被。然后通过对快速生长的非本地牛的放牧来建立牧场。 牧场里的杂草可以通过偶尔的焚烧来控制。一般不使用除草剂、耕作或化肥。当土壤变得贫瘠而被遗弃时，次生林就会发展，这通常比原始森林的植物多样性更低(30)。为ARMO选定的地点是Fazenda Nova Vida研究站，该研究站是亚马逊流域大规模生物圈-大气实验的一部分( www.lbaeco.org/lbaeco )。描述了Fazenda Nova Vida的一般植物群落组成(33)。简单地说，牧草主要是牛尾草(Urochloa brizantha, Urochloa decumbens，原属腕骨属)或圆锥花序(或三种中两种的混合)。 原生林是典型的“有棕榈树的开阔森林”的湿地冷杉林(30)。在原始森林中发现的物种包括Orbignya phalerata, Tabebuia spp.， Erisma uncinatum和Vismia guianensis，尽管大多数物种是未知的。我们站点的土壤是一种红-黄灰壤(Kandiudult)，质地为砂壤土，详细描述过(34)。

样本设计

我们在原始森林和牧场内建立了小块土地。在每个位点建立了一个嵌套抽样方案，以100-m2样方为中心，内嵌10-m2、1-m2、0.1-m2和0.01- m2样方，每100- m2样方共12个采样点。这种空间明确的抽样方案不仅可以评估每个样本站点(alpha多样性)和跨每个土地使用类型(gamma多样性)的丰富程度，还可以评估各个站点的社区组成变化，这是评估beta多样性的一种方法(20)。我们的样本是在雨季结束时(2009年4月13-17日)采集的。采用标准取芯法，将土壤取样至10cm(去除凋落物层后)，均质再细分。土壤分子分析储存在−20°C, 和土壤土壤物理化学性质分析存储在4°C的。

土壤化学分析

在巴西圣保罗大学的能源中心，土壤样品被风干并过a100网筛，通过干燃烧-碳原子化学分析仪进行全镉含量测定。圣保罗大学土壤科学系完成土壤pH、P、S、K、Ca、Mg、Al +和碱基饱和度(%V)在土壤成分分析。

DNA提取，PCR和DNA测序

使用土壤DNA提取试剂盒(MoBioLaboratories)制造商说明书要求，从每个样品中提取三份土壤DNA。提取DNA来自同一土样后, 量化Nanodrop nd - 1000分光光度计,储存在−20°C。两种治疗方法的DNA提取量均值为11.4 ng /μL(±2.3 SD)和9.8 ng /μL(±1.9 SD)森林和牧场样本, 分别对所有样品进行分光光度测定，森林和牧草的分光光度在260 / 280 nm下，分别为1.78和1.84。引物577 f(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′和926 r(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′)针对该地区V4的16S rRNA基因被用于PCR, 因为该区域的序列提供了全面的覆盖(35)和最高的分类学准确率(36,37)。引物和454接头在50μl体系中进行，其中含有1×缓冲区，每种酶0.2ul，1.8ul MgCl₂，200μm脱氧核苷三磷酸，300 Ng/μl BSA，10 ng模板，以及1μl的快速启动高保真PCR酶（罗氏应用科学）。在95°c处以3min启动扩增，随后在45 S处以94°c进行30周变性，45 S处以57°C进行引物退火，在72°C延伸1min，最后延伸4min。采用凝胶电泳技术，再用qiagen PCR纯化试剂盒和qiagen PCR纯化试剂盒对反应进行组合纯化。

在密歇根州立大学的研究技术支持平台，我们采用了Huse等人的建议，用454gs FLX进行了高通量测序。

数据分析

所有的序列处理都是通过生物信息学平台mothur（39）完成的。
如果序列含有碱基N，长度小于300 nt或超过400 nt，或者含有超过20个同多聚物，那么它们就会被丢弃。
这些通过质量过滤的序列，与RDP（核糖体数据库项目 http://rdp.cme.msu.edu）参考比对。利用最远邻域算法计算序列间的两两距离，并在95%和97%的序列相似性下序列合并。
这两个相似的方法给出了质量上相似的结果。最终选择按95%的阈值进行聚类，因为这个阈值可以尽量减少了由于序列错误而导致的人为新物种。
使用随机选择的代表序列和RDF中的分类器平台，将OTUs分配给指定分类学信息。

所有的分析都是用picante软件包进行的(40)。使用R统计平台。
由于土壤样品间的序列数量不相等，样本被随机抽样至1,000条序列，并且样本分析中没有包括不到1 000个序列（只有5个样本不符合这一标准，被排除在外）。
稀疏性重复了30次，之后的每次分析都是以30次随机试验的手段为基础。系统发生育学分析是基于一个树，建立了代表性序列树使用程序FastTree2(41)。
分类上的α多样性是通过使用基于充分覆盖的估计值（ACE）（42）和通过学生T测试进行比较来计算的估计丰富度。系统发生多样性被计算为Faith系统发生多样性（PD）（43）。按分类法计算的群落相似性，
利用anasim（45）对森林和牧场进行了分类和系统发育群落组成的比较。基于地理坐标和物理距离，计算了地点之间的成对地理距离。采用线性回归法，通过相似度与地理距离的回归，确定了群落更替度（即相似度的距离衰减）。
利用物种累积曲线计算了gemma多样性，并对不同地点的样品进行了随机抽样，同时利用ACE测度估计了丰度。通过对不同地点土壤岩心的PD随机采样，计算了系统发育多样性的累积。

引文

Rodrigues, J.L., Pellizari, V.H., Mueller, R., Baek, K., Jesus Eda, C., Paula, F.S., Mirza, B., Hamaoui, G.S., Jr., Tsai, S.M., Feigl, B., Tiedje, J.M., Bohannan, B.J., and Nusslein, K. (2013). Conversion of the Amazon rainforest to agriculture results in biotic homogenization of soil bacterial communities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 988-993.

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