不同构建的SARS-Cov M^pro活性比较及其抑制剂评价

本文为读后感，原文见文后，读后感作者侯彭姣

由SARS-Cov-2感染引起的新冠疫情仍在全球蔓延。截止2020年5月31日，全世界累计确诊新冠肺炎患者已超过601万，累计死亡患者超过36万。疫情爆发至今已近6个月，有效的治疗选择仍然非常有限。除了隔离、治疗，加快特效药物和疫苗的研发将有助于更好更快地战胜病毒。

SARS-Cov-2基因组由约30,000个核苷酸组成。可编码两个有重叠的多蛋白前体pp1a和pp1ab，通过广泛的水解酶的加工，生成病毒转录复制所需的蛋白。而参与这一水解过程的主要蛋白是其编码的Main protein ( M^pro )。M^pro可识别不少于11个保守位点，并通过自切的方式，首先将其自身从pp1a和pp1ab中释放出来，继而水解并产生其他的蛋白成熟体。因此，M^pro作为一种关键的CoV酶，在介导病毒复制和转录中起关键作用，使其成为该病毒的有吸引力的药物靶标。

表达并纯化出产量高，活性好的蛋白酶，对药物开发和蛋白酶基础性质的研究都是一个瓶颈。因此，本文结合之前的研究结果，对SARS冠状病毒的M^pro的构建，表达进行优化，并对其酶活性进行评价。鉴于M^pro在冠状病毒家族中较高的保守性，因此，该研究结果对于新冠疫情相关药物的研发，筛选具有重要的意义。

首先，作者对SARS-Cov的M^pro的进行了不同构建和表达。

作者针对M^pro设计4种不同的构建，进行表达和纯化。具体描述如下：

1. GPLGS-WT：其N端残留5个氨基酸，这5个氨基酸为PGEX-6P-1载体上的氨基酸；

2. GS-WT：在其N端仅残留2个氨基酸；

3. WT-GPH₆：其C端残留8个氨基酸，分别是G,P和6个His;

4. WT: N端和C端无残留的SARS-Cov M蛋白。

    并对4种蛋白的酶活性进行了测定，评价和对比，如下图所示：

通过对比，可发现，WT的酶活性最高，Kcat/Km(M^-1s^-1)为26500；WT的酶活性是GPLGS-WT活性的150倍，GS-WT的20倍，仅是WT-GPH₆的3倍。以上的研究结果提示，M^pro  N端和C端氨基酸的残留对其活性影响，其中C端氨基酸残留影响不大，而N端氨基酸的残留会严重影响其酶活性。

其次，作者通过晶体结构对酶活性之间的差异进行了进一步解释和阐明。

作者分别获得了GPLGS-WT和WT的晶体。GPLGS-WT的晶体属于P2₁空间群，包括2个同源二聚体，分别为protomer A和B，每个protomer含3个结构域。但是只有protomer A是具有活性的，而protomer B由于其N端残留氨基酸使其S1部分破坏而不具酶活性。

而WT的晶体也含有两个同源二聚体，分别是protomer A*和B*，空间群属于C2，且protomer A*和B*均具有活性。这种结构上的变化，从一定程度解释为什么WT对比GPLGS-WT具有较高活性。

此外，作者发现GPLGS-WT活性低于GS-WT的活性，可能是由于GPLGS-WT的N端残留较多氨基酸，而N端残留氨基酸距离其酶活性中心较近所致。但由于C端残留氨基酸距离N端活性中心较远，所以WT-GPH₆活性仅仅是WT的1/3，说明C端氨基酸的残留对酶活性的影响较小。

最后，作者对4种不同构建的SARS-Cov M^pro与抑制剂的结合进行了评价。使用的抑制剂为可与M^pro不可逆结合的抗病毒抑制剂N3，属于米氏受体的一种。评价结果如下所示：

由上可以看出，N3可将WT和WT-GPH₆完全失活，却不能将GS-WT和GPLGS-WT完全失活。以上结果说明N端氨基酸残留对抑制剂的结合有很大影响，很大程度上影响酶的抑制剂评价。

以上研究结果提示，WT构建的SARS-Cov M^pro更适合蛋白的活性实验，以及抑制剂的筛选和评价。这对我们评价其他蛋白酶的活性具有重要意义和参考价值。

原文链接：

1.    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14585926/

2.    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17189639/?from_single_result=10.1016%2Fj.jmb.2006.11.073&expanded_search_query=10.1016%2Fj.jmb.2006.11.073

3.    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272481/?from_term=Structure+of+Mpro+from+COVID-19+virus+and+discovery+of+its+inhibitors&from_pos=1