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不同构建的SARS-Cov Mpro活性比较及其抑制剂评价

已有 628 次阅读 2020-6-2 16:19 |个人分类:读后感|系统分类:论文交流| 构建, SARS-Cov Mpro, 活性比较, 抑制剂, 评价

不同构建的SARS-Cov Mpro活性比较及其抑制剂评价

本文为读后感,原文见文后,读后感作者侯彭姣

由SARS-Cov-2感染引起的新冠疫情仍在全球蔓延。截止2020年5月31日,全世界累计确诊新冠肺炎患者已超过601万,累计死亡患者超过36万。疫情爆发至今已近6个月,有效的治疗选择仍然非常有限。除了隔离、治疗,加快特效药物和疫苗的研发将有助于更好更快地战胜病毒。

SARS-Cov-2基因组由约30,000个核苷酸组成。可编码两个有重叠的多蛋白前体pp1a和pp1ab,通过广泛的水解酶的加工,生成病毒转录复制所需的蛋白。而参与这一水解过程的主要蛋白是其编码的Main protein ( Mpro )。Mpro可识别不少于11个保守位点,并通过自切的方式,首先将其自身从pp1a和pp1ab中释放出来,继而水解并产生其他的蛋白成熟体。因此,Mpro作为一种关键的CoV酶,在介导病毒复制和转录中起关键作用,使其成为该病毒的有吸引力的药物靶标。

表达并纯化出产量高,活性好的蛋白酶,对药物开发和蛋白酶基础性质的研究都是一个瓶颈。因此,本文结合之前的研究结果,对SARS冠状病毒的Mpro的构建,表达进行优化,并对其酶活性进行评价。鉴于Mpro在冠状病毒家族中较高的保守性,因此,该研究结果对于新冠疫情相关药物的研发,筛选具有重要的意义。

首先,作者对SARS-Cov的Mpro的进行了不同构建和表达。

作者针对Mpro设计4种不同的构建,进行表达和纯化。具体描述如下:

1. GPLGS-WT:其N端残留5个氨基酸,这5个氨基酸为PGEX-6P-1载体上的氨基酸;

2. GS-WT在其N端仅残留2个氨基酸;

3. WT-GPH6:其C端残留8个氨基酸,分别是G,P和6个His;

4. WT: N端和C端无残留的SARS-Cov M蛋白。

    并对4种蛋白的酶活性进行了测定,评价和对比,如下图所示:

通过对比,可发现,WT的酶活性最高,Kcat/Km(M-1s-1)为26500;WT的酶活性是GPLGS-WT活性的150倍,GS-WT的20倍,仅是WT-GPH6的3倍。以上的研究结果提示,Mpro  N端和C端氨基酸的残留对其活性影响,其中C端氨基酸残留影响不大,而N端氨基酸的残留会严重影响其酶活性。

其次,作者通过晶体结构对酶活性之间的差异进行了进一步解释和阐明。

作者分别获得了GPLGS-WT和WT的晶体。GPLGS-WT的晶体属于P21空间群,包括2个同源二聚体,分别为protomer A和B,每个protomer含3个结构域。但是只有protomer A是具有活性的,而protomer B由于其N端残留氨基酸使其S1部分破坏而不具酶活性。

而WT的晶体也含有两个同源二聚体,分别是protomer A*和B*,空间群属于C2,且protomer A*和B*均具有活性。这种结构上的变化,从一定程度解释为什么WT对比GPLGS-WT具有较高活性。

 

 

此外,作者发现GPLGS-WT活性低于GS-WT的活性,可能是由于GPLGS-WT的N端残留较多氨基酸,而N端残留氨基酸距离其酶活性中心较近所致。但由于C端残留氨基酸距离N端活性中心较远,所以WT-GPH6活性仅仅是WT的1/3,说明C端氨基酸的残留对酶活性的影响较小。

最后,作者对4种不同构建的SARS-Cov Mpro与抑制剂的结合进行了评价。使用的抑制剂为可与Mpro不可逆结合的抗病毒抑制剂N3,属于米氏受体的一种。评价结果如下所示:

由上可以看出,N3可将WT和WT-GPH6完全失活,却不能将GS-WT和GPLGS-WT完全失活。以上结果说明N端氨基酸残留对抑制剂的结合有很大影响,很大程度上影响酶的抑制剂评价。

以上研究结果提示,WT构建的SARS-Cov Mpro更适合蛋白的活性实验,以及抑制剂的筛选和评价。这对我们评价其他蛋白酶的活性具有重要意义和参考价值。

 

原文链接:

1.    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14585926/

2.    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17189639/?from_single_result=10.1016%2Fj.jmb.2006.11.073&expanded_search_query=10.1016%2Fj.jmb.2006.11.073

3.    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272481/?from_term=Structure+of+Mpro+from+COVID-19+virus+and+discovery+of+its+inhibitors&from_pos=1




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