III型干扰素在控制SARS-CoV-2在原代人肠上皮细胞感染、复制和扩散中的关键作用

 本文为读后感，原文见文后。读后感作者：张楚

 SARS-CoV-2是一个前所未有的世界性健康问题，需要协调一致的全球方法来更好地了解这种病毒，以便开发新的治疗方法来阻止新冠肺炎大流行，并更好地为未来可能出现的新型大流行病毒做好准备。虽然SARS-CoV-2主要针对引起呼吸道感染和病理的肺上皮细胞，但越来越多的证据表明肠上皮也被感染。然而，SARS-CoV-2肠道阶段对病毒诱导的病理、传播和预后的重要性仍不清楚。在这里，作者使用结肠来源的细胞系和原代未转化的结肠有机物，首次对人类肠上皮细胞中SARS-CoV-2的生命周期进行了全面的分析。结果表明，人肠上皮细胞完全支持SARS-CoV-2感染、复制和产生传染性新生病毒颗粒。重要的是，确定肠上皮细胞是繁殖SARS-CoV-2的最佳培养模式。作者发现病毒感染激发了非常强大的内在免疫反应，有趣的是，与I型干扰素相比，III型干扰素介导的反应在控制SARS-CoV-2复制和传播方面明显更有效。综上所述，作者的数据表明，人类肠道上皮细胞是SARS-CoV-2复制的产生部位，并提示SARS-CoV-2的肠道阶段可能通过增加患者病毒血症和刺激细胞因子反应而参与了对新冠肺炎患者观察到的病理过程。

具体结果：

1. SARS-CoV-2能够有效感染人肠上皮细胞

   为了研究病毒在人肠上皮细胞（IECS）中的感染，复制和传播，在vero细胞系中培养SARS-CoV-2(BavPat1株)病毒。为了检测病毒感染，使用针对SARS-CoV-1和SARSCoV-2保守的核蛋白(NP)区域的抗体和检测双链RNA的J2抗体。用SARS-CoV-2感染结肠癌T84和Caco-2细胞，MOI为0.5(在vero细胞中测定)，并在感染后的不同时间用抗NP和抗dsRNA抗体固定细胞并进行免疫染色（图1A）。结果表明，感染SARS-CoV-2的Caco-2细胞早在4hpi就很容易被检测到，到24hpi时，大部分细胞都被感染了(图1B)。在T84细胞中也观察到了类似的结果。但与Caco-2细胞相比，感染的检测略有延迟。尽管同样数量的SARS-CoV-2被用来感染这些细胞，但只有大约20%的细胞在24HPI时被发现感染(图1B)。这些观察结果与病毒基因组拷贝数随时间增加(图1C)和感染T84和Caco-2细胞的上清中释放传染性病毒颗粒(图1D)是一致的。有趣的是，SARS-CoV-2感染IECS与干扰素(IFN)介导的固有免疫反应的产生有关。伴随着在T84和Caco-2细胞之间观察到的病毒复制和新病毒产生的差异，T84细胞比Caco-2细胞安装了更强的免疫反应(图1E)，尽管感染的T84细胞要少得多(图1B)。综上所述，这些结果表明IECs很容易被SARS-CoV-2感染，感染Caco-2细胞导致的内源性免疫反应较弱，这与T84细胞相比产生更多的新生感染性病毒有关。这一观察结果提示干扰素介导的免疫反应控制了IECS中SARS-CoV-2的感染。

2. 干扰素抑制人肠上皮细胞感染SARS-CoV-2

   为了直接检测IFNs在控制/限制SARS-CoV-2在人IECS中复制和扩散的作用，用I型(IFNb1)和III型(IFN1)IFNs模拟或预处理T84和Caco-2细胞。治疗24小时后，在存在或不存在IFN的情况下，以MOI为0.5(在Vero细胞中测定)感染SARS-CoV-2细胞(图2A)。用抗NP和抗dsRNA抗体对24个HPI细胞进行免疫组化染色。结果表明，任一种IFN预处理细胞都显著干扰了T84和Caco-2细胞的SARS-CoV-2感染(图2B)。用任一种IFN预处理SARS-CoV-2感染细胞的数量的减少，与抑制病毒基因组拷贝数的增加(图2C)，和显著减少传染性新生病毒颗粒的释放(图2D)有关。这些结果表明干扰素介导的免疫应答可以控制SARS-CoV-2在人IECS中的感染。

3. 干扰素介导的内源性免疫应答控制人肠上皮细胞感染SARS-CoV-2

     为了解IECS产生的内源性IFN水平是否控制SARS-CoV-2的复制和传播， I型IFN受体(IFNAR1)(AR-/-)、III型IFN受体(IFNLR1)(LR-/-)或两种IFN受体都缺失(DKO)的IECS。 用SARS-CoV-2感染WT或IFN受体敲除的T84细胞，MOI为0.1(T84细胞测定)。用抗NP抗体对24个HPI细胞进行免疫染色，感染细胞数为用荧光显微镜定量(图3A)。结果表明，I型干扰素受体(AR-/-)耗尽后，感染细胞数量略有增加。重要的是，III型干扰素受体(LR-/-)的耗尽导致细胞感染性大幅增加约7倍。当I型和III型IFN受体都耗尽(DKO)时，也得到了类似的结果(图3B)。有趣的是，III型IFN受体(LR-/-)耗尽后感染细胞数量的增加与病毒基因组拷贝数的显著增加(图3C)和新生感染病毒产量的三个数量级增加(图3D)有关。综上所述，这些结果提示III型IFN介导的免疫应答积极参与控制SARS-CoV-2在人IECS中的感染。为了明确干扰素介导的抗病毒反应的重要性，作者使用了PAN-JAK抑制剂(吡啶酮-6)来抑制STAT1的磷酸化激活，并阻断干扰素刺激基因(ISGs)的产生。用SARS-CoV-2感染模拟细胞和吡啶酮-6预处理的T84细胞24小时，用抗NP抗体进行免疫染色，荧光显微镜观察分析。结果显示，在PAN-JAK抑制剂处理的细胞中，感染细胞的数量显着增加(图3e)，病毒基因组拷贝数增加(图3F)。重要的是，与在耗尽III型IFN受体的细胞中观察到的结果一致，这种传染性的增加也与传染性新病毒颗粒产生的增加有关(图3g)。总之，这些结果有力地支持了III型干扰素介导的信号控制人类肠道上皮细胞感染SARS-CoV-2的模型

4. 人类原代肠道有机物支持SARS-CoV-2感染、复制和传播

   为了解原代人类IECs是否可以被SARS-CoV-2感染并支持新病毒的产生，使用了来自两个不同捐赠者的人结肠来源的有机物。利用共聚焦荧光显微镜(图4A)和针对细胞类型特异性的定量RT-PCR证实了对所有类型的细胞(例如，肠细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和干细胞)的完整的超微结构组织和分化(图4B)。经充分分化后，有机物被SARS-CoV-2感染。在24HPI时，通过使用抗NP和抗dsRNA抗体的免疫染色以及定量RT-PCR来分析感染情况(图4C)。结果表明，与供体无关，结肠类器官很容易被SARS-CoV-2感染，这一点从NP和dsRNA阳性细胞的存在中注意到(图4D)。定量显示在每个供体中大约有8-13%的细胞被感染(图4e)。这种感染与病毒基因组拷贝数的增加有关(图4F)。有趣的是，有机物感染没有导致I型干扰素(IFNb1)的产生，而是III型干扰素(IFN1)的极大上调(图4G和图4G)。S3)。为确定外源性干扰素能否预防SARS-CoV-2感染，模拟或用IFNb1和IFN1预处理结肠器官，然后感染SARS-CoV-2 24小时。结果表明，用IFNb1和IFN1预处理结肠有机物可显著降低感染(图4H)。这与SARS-CoV-2基因组拷贝数的减少(图4I)和传染性新生病毒颗粒产生的减少(图4J)有关。综上所述，这些结果表明人结肠有机体能够支持SARS-CoV-2的感染、复制和传播，而III型IFN应答在控制病毒复制中起着关键作用。

原文链接：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.24.059667v1.full.pdf