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[转载]好文分享｜天然甲基营养菌应用于甲醇生物制造
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Review Article
Engineering the native methylotrophs for the bioconversion of methanol to value-added chemicals: current status and future perspectives
Jing Wang, Ruirui Qin, Yuanke Guo, Chen Ma, Xin Wang*, Kequan Chen*, Pingkai Ouyang
https://doi.org/10.1016/j.gce.2022.10.005
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1 文章导读
目前多数生物制造过程都是基于糖质原料，存在着与人争粮等问题。甲醇作为一种重要的非食品原料，以其成熟的生产和来源广泛被认为是一种具有潜力的替代碳源。近年来，CO2加氢合成甲醇技术的提出为甲醇成为一种可持续的、绿色的、可再生的非粮食基原料开辟了道路。因此，建立高效将甲醇转化为有价值的化学品的微生物细胞工厂是非常可取的。甲基营养菌是一种可以利用甲醇作为唯一碳源和能量来源生长的微生物，是甲醇生物转化的有前途的寄主。同时，合成生物学和系统生物学工具包的进步提高了天然甲基营养菌的可加工性，以生产增值产品，使其成为甲醇生物转化的理想宿主。
近期，南京工业大学生物与制药工程学院陈可泉教授课题组在Green Chemical Engineering (GreenChE) 上发表了题为“Engineering the native methylotrophs for the bioconversion of methanol to value-added chemicals: current status and future perspectives”的综述性文章，总结了天然甲基营养菌利用甲醇的途径以及现有的基因编辑工具，并讨论了提高天然甲基营养菌甲醇利用效率的策略，对目前天然甲基营养菌利用甲醇合成高附加值化学品等进行了整理。
2 内容概述
本文阐述了天然甲基营养菌利用甲醇的4条途径，即单磷酸木酮糖途径（XuMP）、单磷酸核酮糖途径（RuMP）、丝氨酸途径（Serine）和伍德-永达尔途经（WLP）及其相关基因编辑工具，并总结了这些途经用于甲醇利用合成一系列高价值化学品如：有机酸、脂肪酸和健康化学品等（如图1所示）。此外本文还讨论了天然甲基营养菌在甲醇生物制造应用中面临的主要挑战和可能的解决方案。
图1. 天然甲基营养菌基于甲醇的生物制造。
01 天然甲醇利用途径
在所有天然有氧甲基营养菌中，甲醇代谢的第一步均为甲醇到甲醛的氧化，此步由甲醇脱氢酶（MDH）催化，依据利用辅因子种类的不同，该酶可以分为三种，分别为依赖NAD、PQQ和O2的甲醇脱氢酶。通过对比三种甲醇脱氢酶，可以得出在催化甲醇氧化过程中，NAD依赖型的甲醇脱氢酶的电子保留率最高，有利于生产还原性的代谢产物，但在热力学上该反应并不利于甲醇的氧化且这类酶对甲醇的亲和性和催化活性较低。第二步是将甲醛同化为中心碳代谢，目前在有氧甲基营养菌中包括单磷酸木糖（XuMP）循环、单磷酸核糖（RuMP）循环和丝氨酸循环。与其他两种途径相比，丝氨酸途径的碳效率最高，但也是能量消耗最大的途径。在三个途径中，RuMP途径的能量效率最高，因此也是目前合成甲基营养菌研究较多的。
在厌氧甲基营养菌中，甲醇主要通过WLP进行代谢，WLP由两个不同的分支组成--甲基和羰基分支。在厌氧甲基营养菌中，甲醇转化为生物质或产品的能量效率要高于有氧甲基营养菌。此外，由于WLP途径的存在，厌氧产酸菌还可以同化其他C1化合物，如CO2和CO，而且甲醇的同化也与CO2的固定耦合。这些优势也使厌氧菌成为甲醇生物转化的理想微生物。
图2. 天然甲基营养菌的甲醇同化途径。
02 天然甲基营养菌的基因工具
质粒的开发对于天然甲基营养菌的代谢至关重要，能够提高产品产量和得率。本文总结并列出了目前已开发的适用于天然甲基营养菌中的相关质粒。同时还介绍了目前已有的相关基因编辑工具如：转座子诱变、CRISPR-Cas、同源重组和CRISPRI。其中近期开发的CRISPRI系统为天然甲基营养菌的基因工程改造提供了一种实用的工具。
图3. 天然甲基营养菌的基因编辑工具。
03 天然甲基营养菌的甲醇利用效率提高策略
尽管天然甲基营养菌具有从甲醇生产增值化学品的潜力，但其效率受到甲醇利用率的限制。课题组总结了一些潜在的策略，以期提高天然甲基营养菌的甲醇利用能力。主要包括改造代谢调控甲醇利用途径，提高甲醇耐受能力以及酶组装甲醇利用相关基因。
图4. 甲醇利用效率提高策略示意图。
04 天然甲基营养菌利用甲醇合成高价值化学品
到目前为止，天然甲基营养菌中B. methanolicus已经被用来合成众多氨基酸，如赖氨酸和谷氨酸。而M. extorquens最近被改造用于甲醇生产紫色杆菌素、二羧酸以及多羟基烷酸。此外，具有重大工业意义的是甲基营养型酵母。特别是P. pastoris经常用作生产重组蛋白的表达宿主。在这篇文章中，课题组整理了天然甲基营养菌的最新进展，总结并列出了目前利用甲醇合成高价值化学品的相关研究。
图5. 天然甲基营养菌利用甲醇合成化学品示意图。
3 总结与展望
甲醇由于来源丰富和生产技术成熟，是生物生产潜在发酵原料。天然甲基营养菌可以利用甲醇作为唯一的碳源和能源，由于其较高的甲醇利用率，是甲醇生物转化的理想宿主，并已被广泛用于从甲醇生产增值化学品。该工作回顾了天然甲基营养菌的天然甲醇利用途径以及目前已开发的基因工具，并讨论了提高其甲醇利用效率的策略。最后，总结了天然甲基营养菌从甲醇中生产增值品的代表性例子。但是与合成型甲基营养菌相比仍然存在缺乏有效基因编辑工具以及产物谱有限等问题。本文提出了微生物联合体概念，采用共培养或两阶段发酵等方法可以拓宽产物谱；同时随着CRISPR技术的不断发展，尤其是P. pastoris中CRISPR-Cpf1系统被开发出来，有望解决天然甲基营养菌的基因操作困难等问题；最后，合成生物学和代谢工程的最新发展为设计合成甲基营养菌提供了可能性，以便利用甲醇作为原料生产增值产品。
4 通讯作者简介
王 昕 教授
王昕，博士，南京工业大学生物与制药工程学院教授，333高层次人才培养工程第三层次、江苏省低碳技术学会拔尖青年科学家、南太湖精英计划创新领军人才。
面向“双碳目标”的国家战略导向，专注非粮基原料的高效利用以及高值化学品的绿色生物合成研究。目前已在生物制造领域知名期刊发表学术论文50余篇，其中以通讯作者或第一作者在ACS Sustain Chem Eng、Bioresource Technol、Biotechnol Bioeng、Biotechnol Biofuels等刊物发表SCI论文28篇，授权中国发明专利18件，参与撰写学术专著1本。作为负责人，主持国家自然科学基金面上基金、青年基金、国家重点研发计划、中央军委装备预研专项、江苏省协同创新中心青年基金和面上项目等8项，与中石油、德国科思创聚合物有限公司、广州开平牵牛生化有限公司等企业开展横向项目合作6项。担任Front Bioeng Biotech、Molecular catalysis等国际期刊的评审编辑。
陈可泉 教授
陈可泉，博士，南京工业大学生物与制药工程学院副院长，教授，教育部“青年长江学者”。入选江苏省六大人才高峰、江苏省333人才工程、江苏省青蓝工程、江苏省“六大人才高峰”高层次人才培养计划、教育部青年长江学者。兼任《Bioresources and Bioprocessing》青年编委，《合成生物学》编委，中国化工学会过程强化青年委员会委员，江苏省生物技术协会青年专业委员会副主任委员等职。
主要从事材料单体的生物制造及应用研究，涉及生物催化剂的构建、生物反应器过程强化、产品分离及应用等。承担了中央军委装备预研专项、国家重点研发计划、国家自然科学基金等多项科研项目，与德国科思创公司、中国兵器集团、中海油、中粮集团等多家企业开展了项目合作。目前发表SCI论文90余篇，获得授权的国家发明专利30余项，出版专著1本。近年来获国家技术发明二等奖1项、教育部技术发明奖二等奖1项、中国石油和化学工业联合会技术发明二等奖1项、侯德榜化工科技青年奖1项。
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