Q：常见近源种鉴定的方法？

A：16S rRNA序列比较保守，一般情况下只能在种以上水平区分，种下水平很难区分，16S rRNA的相似性可能达99%以上，这个时候就无法用于菌种的鉴定。有以下解决办法：

1.进行ANI（average nucleotide identity）分析，即平均核苷酸相似性分析，在全基因组层面进行比较分析，尤其适用于鉴定新的菌株和物种；

2.进行核心基因MLST分型（Core Genome Multilocus Sequence Typing, cgMLST），即通过同种或同属的基因组比较，进行菌株鉴定，该操作的基本思路是：获得全基因组的基因序列信息，在基因的蛋白组序列层面上与多株菌的基因组所有基因进行相互比较，即进行同源基因分析，通过一定的筛选条件如相似度大小和覆盖度多少等找到core genome genes，一般各个基因组的核心基因大概有1200-2500个（取决于物种基因组的大小和所选择的其他基因组的亲缘关系），在此基础上，进一步选择单拷贝的核心基因，构成一个基因集，最后将各个基因组中的单拷贝核心基因按照特定的顺序串联起来，变成一段很长的序列，用这段包含有上千个基因的序列代表该基因组，进行进化树构建，即获得了cgMLST结果。

其他微生物基因组分析常见问题：

Q1：什么是GeneBank？

A1：GeneBank是美国全国卫生研究所维护的基因序列数据库，其中汇集注释了所有公开的核酸序列，与日本的DNA数据库DDBJ以及欧洲分子实验室核酸序列数据库EMBL一起，都是国际核苷酸序列数据库合作的成员。

Q2：如何在细菌基因组上预测操纵子？

A2：目前在基因组层面上进行操纵子预测结果不是很可靠，假阳性比较高，一般都要结合基因表达数据、代谢网络等信息，建议可以根据已报道的近源物种中的操纵子信息去查看测序菌株上是否有相关的元件。

另外，一般情况下，操纵子上游有一个启动子，下游有一个终止子，基于这一特征可以通过识别操纵子上游的启动子或下游的终止子来预测操纵子，而且操纵子和启动子预测的目的也比较相似，可以考虑进行启动子预测。

Q3：细菌基因组中，预测的蛋白序列为什么必须以M开头?

A3：第一个M不行使功能，是甲酰甲硫氨酸，一种被修饰的甲硫氨酸残基，其α氨基被甲酰化，出现于细菌、噬菌体、真核生物线粒体和叶绿体的新生多肽链的N端，以AUG或GUG等为密码，即起始密码子。

Q5：哺乳动物线粒体基因组有什么特点？

A5：1）线粒体基因组全序列～14-20kb；2）线粒体基因组DNA没有内含子，几乎每一对核苷酸都参与一个基因的组成，有许多基因的序列是重叠的，人线粒体基因组16569 bp，除了同启动DNA有关的D环区(D-loop)外，只有87个碱基不参与基因的组成；3）线粒体中共37个基因，包括：13个蛋白编码基因（PCG）、22个转运RNA（tRNA）、2个核糖体RNA（rRNA）。

Q6：叶绿体基因组有什么特点？

A6：1）双链环状DNA，大小一般介于120 K-217 K之间；2）结构组成保守：由4部分结构组成：两个反向重复序列（IR）、一个短单拷贝序列（short single copy , SSC）、一个长单拷贝序列（ LSC）；3）基因组成保守：大小虽不相同，但基因组成相似。

Q7：CRISPR分析和前噬菌体分析的意义？

A7：CRISPR-Cas系统是一种天然存在于基因组上的免疫系统。在原核生物中，CRISPR 起到免疫系统的作用，对外来的质粒和噬菌体序列具有抵抗作用。CRISPR 能识别并使入侵的功能元件沉默。

CRISPR-Cas9是最常见的基因编辑系统，能够进行基因的定点插入和删除。基因组上存在CRISPR系统，说明这个基因组上的基因很可能在进化过程中发生编辑，并且可以抵御外来核酸的入侵，维持基因组的稳定性，对物种在复杂环境中的生存具有重要作用。

前噬菌体序列的存在可能也会允许一些细菌获取抗生素抗性，增强对环境的适应性，提高粘附力或使细菌成为致病菌。同时，通过前噬菌体的研究可能找到特异的抗生素甚至是先进的癌症治疗方法。

Q8：什么是MLST（Multilocus sequence typing）多位点序列分型？

A8：一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，通过PCR扩增多个管家基因内部片段，测定其序列，分析菌株的变异，从而进行分型。MLST被广泛应用于病原菌、环境菌和真核生物中。能将同种细菌分为更多的亚型，并确定不同ST型之间的系统发育关系以及与疾病的联系。操作简单，结果能快速得到并且便于不同实验室的比较，已经用于多种细菌的流行病学监测和进化研究。

原理：MLST方法一般测定6~10个管家基因内部400~600bp的核苷酸序列，每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱，也就是这株菌的序列型（sequence type，ST）。这样得到的每个ST均代表一组单独的核苷酸序列信息。通过比较ST可以发现菌株的相关性，即密切相关菌株具有相同的ST或仅有极个别基因位点不同的ST，而不相关菌株的ST至少有3个或3个以上基因位点不同。

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