博文

可扩展单细胞总RNA测序统一编码和非编码转录组学

已有 248 次阅读 2026-5-16 21:39 |个人分类:科普|系统分类:科普集锦

可扩展单细胞总RNA测序统一编码和非编码转录组学

非聚腺苷酸化 RNA 在转录组中占据重要且功能多样的份额。这些 RNA 包括 microRNA（miRNA）、长链非编码 RNA（lncRNA）、小核仁 RNA 和小核 RNA（snoRNA、snRNA）、环状 RNA（circRNA）、转移 RNA（tRNA）、组蛋白 mRNA 以及许多天然缺乏 polyA 尾的病毒转录本。它们在转录调控、RNA 加工、翻译、应激反应和细胞命运转变中发挥着至关重要的作用。然而，由于传统的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）平台依赖于 polyA 尾的捕获，因此这些转录本大多无法被检测到，而 scRNA-seq 平台本身也存在对蛋白质编码 mRNA 的偏向性。

尽管诸如 Smart-seq-total、VASA-seq、RamDA-seq、snapTotal-seq、MATQ-seq 和 scComplete-seq 等专用方案已将单细胞分析扩展到包括某些非聚腺苷酸化 RNA，但这些方法通常需要定制设备、定制酶、大量的样本处理或定制的计算流程，这些因素限制了它们的可扩展性以及与高通量和广泛应用的工作流程的集成。此外，大多数此类方法要么性能不佳，要么完全无法捕获成熟的 miRNA，而 miRNA 在发育、免疫和疾病中发挥着关键作用。因此，这些方法均未被用于生成图谱规模的数据，其应用范围仍然主要局限于原理验证或小规模研究。因此，大多数单细胞研究系统性地排除了 RNA 生物学的很大一部分，导致在绘制涉及非编码转录本的调控网络、细胞状态和疾病机制图谱时存在盲点。

最近，Isakova等人提出了一种通用且可扩展的单细胞总 RNA 谱分析框架TotalX（图1），该框架与商业化的高通量微流控单细胞分析系统完全兼容。该方法仅需少量生化和计算方面的改进，即可捕获短链和长链的聚腺苷酸化和非聚腺苷酸化 RNA，从而在不牺牲通量、可访问性或与现有流程和数据集的互操作性的前提下，实现广泛应用。

图1 TotalX 可实现对编码和非编码 RNA 的可扩展检测，包括 miRNA 在内的单细胞内 RNA 的检测。a，TotalX 方案示意图。总 RNA 经多聚腺苷酸化后，使用定制的模板转换寡核苷酸 (dUTSO) 进行逆转录。逆转录后，用 UDG 酶切 TSO，并使用基于 Cas9 的 DASH 酶在预扩增 (Pre-amp) cDNA 水平去除 rRNA。长片段 (>400 bp) 和短片段 (<400 bp) 分别进行索引，并可选择加入凝胶纯化的 miRNA 片段 (~18–50 bp)，然后混合进行测序。b，不同技术的基因检测效率。比较 TotalX (绿色)、VASA-seq (橙色) 和 10x Genomics 3′ 化学方法 (蓝色) 在不同测序深度下，每个细胞的平均基因数与 UMI 的关系。c，UMI 下采样后每个细胞检测到的独特基因数。基因检测结果已标准化至每个细胞 20,000 个 UMI。TotalX 产生的基因复杂度与 VASA-seq 相似，且高于标准的 10x Genomics Chromium 3′ 工作流程。中心线表示中位数，箱体表示四分位距（第 25 至 75 百分位数），须线延伸至最小值和最大值。每把小提琴的宽度代表数据的核密度。样本量在每个图上方标明。d，每种 RNA 生物类型检测到的独特基因总数。径向图显示了每种方法在代表性实验中检测到的独特基因数量，并按 RNA 生物类型细分：蛋白质编码 RNA、lncRNA、其他 RNA (miscRNA)、miRNA、snoRNA、snRNA、tRNA 和组蛋白 RNA。比率表示检测到的基因占每种生物类型中注释基因总数的比例。仅统计在 10 个或更多细胞中检测到的基因。e，改进使用混合文库输入检测 miRNA。散点图显示了 HEK293T 细胞中单独使用 TotalX（x 轴）与添加 miRNA 组分的 TotalX（TotalX miRNA(+)）（y 轴）的平均每百万计数 (CPM)。已知的 HEK293T 特异性 miRNA（红色）的表达水平与低表达和中等表达的蛋白质编码基因（蓝色）相当

作者们将此框架应用于涵盖多种生物系统的超过 50 万个单细胞。在外周血单核细胞（PBMC）中，检测到非编码 RNA（包括 miRNA、tRNA 和 lncRNA）的显著细胞类型特异性表达，并揭示了编码和非编码共表达模块的调控结构。在感染非聚腺苷酸化 RNA 病毒的细胞中，捕获了宿主和病毒的转录本，揭示了基于聚腺苷酸化的实验方案所遗漏的抗病毒程序。在发育中的人脑中，发现了数百种动态调控的非编码 RNA，它们追踪发育转变和谱系分化。总而言之，该工作建立了一种稳健、易用且可扩展的单细胞分辨率全 RNA 分析策略，提出的综合数据集揭示了传统方法无法检测到的调控结构。

参考文献

[1] Isakova A, Liu DD, Cvijović I, Sinha R, Eastman AE, Saul S, Detweiler AM, Neff N, Einav S, Weissman IL, Quake SR. Scalable single-cell total RNA sequencing unifies coding and noncoding transcriptomics. Nat Biotechnol. 2026 Mar 31. https://doi.org/10.1038/s41587-026-03068-6

以往推荐如下：

1. 分子生物标志物数据库MarkerDB

2. 细胞标志物数据库CellMarker 2.0

3. 细胞发育轨迹数据库CellTracer

4. 人类细胞互作数据库：CITEdb

5. EMT标记物数据库：EMTome

6. EMT基因数据库：dbEMT

7. EMT基因调控数据库：EMTRegulome

8. RNA与疾病关系数据库：RNADisease v4.0

9. RNA修饰关联的读出、擦除、写入蛋白靶标数据库：RM2Target

10. 非编码RNA与免疫关系数据库：RNA2Immune

11. 值得关注的宝藏数据库：CNCB-NGDC