英文原题：Rational Design of d-hydantoinase from Pseudomonas aeruginosa for Desymmetric Synthesis of Chiral Intermediate for S-Pregabalin

作者：Feixia Liu, Huili Zhao, Zhongdong Shang, Fa Zhang, Tristan de Rond, Bo Yu*

01 论文信息

论文信息

Liu F, Zhao H, Shang Z, et al. Rational Design of d-hydantoinase from Pseudomonas aeruginosa for Desymmetric Synthesis of Chiral Intermediate for S-Pregabalin[J]. Green Carbon, 2025.

论文网址

https://doi.org/10.1016/j.greenca.2025.02.002

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Rational Design of d-hydantoinase from Pseudomonas aeruginosa for Desymmetric Synthesis of Chiral Intermediate for S-Pregabalin

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Green Carbon文章 | 中国科学院微生物研究所于波研究员：海因酶理性设计合成普瑞巴林手性中间体

02 背景简介

立体选择性是现代催化剂的一个重要方面，可以显著影响产品的性质。与化学方法相比，环境友好型的酶促合成法获得了极大的关注，特别是在药物合成方面。普瑞巴林（（S）-3-（氨基甲基）-5-甲基己酸，S-PGB）是一种重要的镇痛、抗惊厥和抗焦虑药物。目前合成方法主要使用区域和立体特异性腈水解酶作为生物催化剂将外消旋异丁基琥珀腈（ISBN）转化为手性中间体（S）-3-氰基-5-甲基己酸。除此之外，利用3-异丁基戊二酰亚胺（IBI）作为底物则具有更高的原子经济性，经过碱水解获得混消旋的R/S-单酰胺，化学拆分后获得中间体R-单酰胺。

中国科学院微生物研究所于波研究员团队于Green Carbon发表题为“Rational Design of d-hydantoinase from Pseudomonas aeruginosa for Desymmetric Synthesis of Chiral Intermediate for S-Pregabalin”研究论文，该文章基于理性设计对来自铜绿假单胞菌中的D-海因酶进行了活性口袋重塑以及柔性C-末端和非保守的表面氨基酸残基改造。

结果表明，产物R-单酰胺光学纯度（ee_p）从初始的65.51% ± 5.85% 提升至98.62% ± 0.28%，催化速率（k_cat/K_m （s⁻¹•M⁻¹））提升了22.8倍，半衰期提升4.5倍。

03 文章简介

基于空间位阻的活性口袋重塑，提高产物光学纯度

本研究中通过调节空间位阻和重塑结合袋来提高R-单酰胺的产量。结果表明突变体M3 （L64A/F66H/C318T）产物光学纯度提升至98.62% ± 0.28%（ee_p），催化速率（k_cat/K_m） 提升至 207.06 s⁻¹•M⁻¹。分子动力学模拟显示水分子中的羟基与初始功能酰胺基团（C1）形成氢键（2.3 Å），促进开环水解形成R-异构体产物。同时氨基酸残基A64、T318和H66与底物侧链的疏水相互作用有助于稳定底物的取向。此外，T318与残基D316形成范德华力相互作用，不仅增加了结合口袋的极性，也增加了D316的pKa，从而有利于底物的结合和水解。

酶的表面区域理性设计以及C末端共进化分析提高催化性能

根据HotSpot Wizard 3.0和FireProt预测对酶表面的非保守位点进行突变验证。结果表明，突变体的催化活力以及热稳定性有不同程度提高。与突变体M3相比，突变体M3- R99G热处理前后的催化活性分别提高了58.6% ± 0.9%和16.4% ± 2.0%。突变体体积大大减小，正电荷消失，表明电荷-电荷相互作为对于维持酶的结构稳定性具有重要作用。

海因酶的柔性且不保守的C末端被认为不是催化反应的必需模块，但会影响亚基之间的相互作用和进一步的寡聚化。本研究基于ASR祖先序列重构以及共进化分析对C末端进行理性改造。为了获得综合性能优异的突变体，结合表面活性位点改造，构建迭加突变文库。L64A/F66H/C318T/R99G/G466N/A265P（M5）表现出优异的热稳定性，其半衰期大幅提高达到5.37 h，孵育60 h后仍保持23.4%的相对活性。在L64A/F66H/C318T/R99G/G466N/A265P/E470A（M6）中出现了活性-稳定性失衡现象，k_cat/K_m增加到662.3 ± 6.8（s⁻¹•M⁻¹），半衰期则减少到4.14 h，但通常认为催化活性的大幅增加可以抵消热稳定性的轻微下降。分子动力学模拟的结果进一步阐明了催化活力以及热稳定性提高的机制。

总结及展望

本研究对铜绿假单胞菌来源的D-海因酶进行活性口袋重塑以及酶表面氨基酸和C末端残基的理性设计，获得了催化活力和光学纯度都具有显著优势的多点突变体M6。评价了以恶臭假单胞菌KT2440为表达平台的M6变异株的工业应用前景。该酶法催化步骤可直接嵌入到目前的化学合成工艺，无需进行大的工艺条件变动即可实现普瑞巴林的化学-生物酶法耦合合成，显著提升了合成路径的绿色指数，具有较好的经济性。

04 作者简介

于波 研究员

于波，博士，现任中国科学院微生物研究所研究员、研究组长、微生物生理与代谢工程研究室主任；兼任北京微生物学会副理事长、工业微生物专业委员会主任（2017-），中国微生物学会理事（2021年-），中国农业生物技术学会理事（2021-），中国食品科学技术学会有机酸分会第五届委员（2023-），全国发酵工程技术工作委员会第四届委员（2024-）。主要从事基于合成生物学和系统代谢工程的工业微生物技术方面的研究。在基因线路设计、人工途径设计与菌株系统优化等领域已在国际生物技术主流期刊发表文章100余篇，授权专利20余项；主持完成多项专利技术转化。

05 Green Carbon

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