原文链接：annurev-biophys-101220-072829.pdf (annualreviews.org)

Directed Evolution of Microbial Communities

微生物群落的定向进化

Álvaro Sánchez, Jean C.C. Vila, Chang-Y u Chang, Juan Diaz-Colunga, Sylvie Estrela, and María Rebolleda-Gomez

Department of Ecology & Evolutionary Biology and Microbial Sciences Institute, Yale University, New Haven

 Keywords

directed evolution, microbial communities, artificial ecosystem selection, structure–function landscape, collective community functions

 Abstract

Directed evolution is a form of artificial selection that has been used for decades to find biomolecules and organisms with new or enhanced functional traits. Directed evolution can be conceptualized as a guided exploration of the genotype–phenotype map, where genetic variants with desirable phenotypes are first selected and then mutagenized to search the genotype space for an even better mutant. In recent years, the idea of applying artificial selection to microbial communities has gained momentum. In this article, we review the main limitations of artificial selection when applied to large and diverse collectives of asexually dividing microbes and discuss how the tools of directed evolution may be deployed to engineer communities from the top down. We conceptualize directed evolution of microbial communities as a guided exploration of an ecological structure–function landscape and propose practical guidelines for navigating these ecological landscapes.

摘要

定向进化是一种人工选择的形式，几十年来一直被用来寻找具有新的或增强的功能特征的生物分子和生物。定向进化可以被概念化为对基因-表型图谱的引导探索，其中具有所需表型的遗传变异首先被选择，然后被诱变以搜索基因空间以寻找更好的突变体。近年来，将人工选择应用于微生物群落的想法获得了势头。在这篇文章中，我们回顾了人工选择在应用于大规模和多样化的无性分裂微生物集体时的主要限制，并讨论了定向进化的工具如何自上而下地应用于设计群落。我们将微生物群落的定向进化概念化为对生态结构-功能景观的引导探索，并提出了导航这些生态景观的实用指南。

目录

生物体和生物分子的定向进化 ........................................ 324

生物体以上水平的人工选择 ......................................... 325

人工选择的条件：遗传性和变异 ..................................... 325

种群和小型合成群落的人工选择 ................................... 325

微生物群落和生态系统的人工选择 ................................. 327

限制群落水平人工选择成功的因素是什么？ .................... 327

人工选择作为自上而下的工程 ........................................ 328

定向进化作为对生态结构-功能景观的引导探索 ................. 329

微生物群落的动态生态结构-功能景观 ............................. 330

微生物群落定向进化：探索生态结构-功能景观的方法 ...... 330

微生物群落定向进化：群落水平的选择和遗传性 .............. 333

总结与展望 ............................................................... 333

### 生物体和生物分子的定向进化

进化塑造了所有形式的生命，并且人类几千年来一直利用其力量。我们的祖先早在了解进化本身之前，就已经学会通过人工选择来驯化动物、植物和各种微生物（27, 92）。十九世纪和二十世纪我们对进化生物学、遗传学和分子生物学的理解的革命性进展，加上新型基因组和分子技术的发展（1, 31, 100, 102, 115），使我们能够将人工选择扩展到动物和植物驯化之外，并学习如何定向进化生物分子（12, 48）、基因电路（126）、微生物（80）和病毒（16），以改善它们的表型，甚至创造新的表型（48, 81）。利用定向进化从上到下设计生物系统的一个主要优势是，后者工作于已经知道的部分和特性，而前者不需要对所需功能的机制有任何先验知识；因此，定向进化可能使我们发现隐藏在基因型空间中尚未探索区域的全新途径和机制。

除了其实用性之外，定向进化还可以导致对基本生物学原理的深刻见解。例如，体外和计算机模拟的定向进化揭示了遗传和代谢网络的组织原则（11, 34, 125, 126），并且它对我们越来越深入理解生物分子的基因型与表型之间的映射关系起到了重要作用（14, 89, 108）、代谢途径（79）以及其他细胞特性（115）。反过来，随着我们对适应的遗传基础的理解的改进，它使我们能够设计出更有效的定向进化策略和方法（1, 6, 7, 64, 89, 102, 128）。

基因型–表型图（在定向进化的背景下通常称为适应度景观）定义为基因的DNA序列（或更高级的功能单位，如代谢途径或遗传网络）与其在给定环境中编码的数量性状的大小之间的关系。定向进化可以被概念化为对这一基因型–表型图的引导探索，以寻找具有改进或新功能的基因型（89, 108）。传统上，定向进化首先通过生成一个基因变体库开始（74）。然后对所有变体进行表型选择评分，并选择那些接近所需表型值的变体（称为最适者）进行繁殖。从这个选择的群体中，通过随机诱变或重组产生新一代基因变体（74）。这种两步过程通常迭代进行，直到达到所需的进化轮次。近年来，已经开发出几种技术，这些技术增加了该过程的通量并减少了人为干预（31, 115），但基本的进化过程保持不变（64, 90）。

### 生物体以上水平的人工选择

鉴于个体群体（种群、群落和生态系统）在自然和技术过程中的诸多重要作用越来越受到重视（13, 49, 57, 63, 69, 72, 84, 97, 110, 120），有学者提出，人工选择也可以应用于生物体以上的水平，从上到下设计和工程化群落水平的功能（25, 72, 104）。

### 人工选择的条件：遗传性和变异

原则上，人工选择可以应用于任何生物组织水平，只要进化单位在选择轴上表现出表型变异，并且这类变异的很大一部分能够可靠地从父代传递给子代（66）（图1a）。在生物体水平上，选择可以非常有效，因为生物体满足这两个条件：生物体的表型（至少部分地）由其基因型决定，而基因型部分或全部由父代传递给子代。这确保了许多表型具有可遗传的成分，选择可以作用于这些成分。自然选择所需的条件（除了上述两项，还包括表型差异必须与复制单位之间的适应度差异相关联（66））是否在自然界中的超个体实体中得到满足一直存在争议。然而，有坚实的实证和理论证据表明，在人工选择条件下，这些条件是可以满足的（15, 26, 40, 43, 65, 111, 113, 114, 118, 119, 123）。

### 种群和小型合成群落的人工选择

群体水平选择可以影响生物群体的想法最初在小型动物种群（111, 112）和双物种群落（40, 43）中进行了测试。在这些实验中，选择单位是包含约10个遗传多样的、进行有性繁殖的面粉甲虫（Tribolium属）动物的种群，这些个体只与同种群的其他个体互动，不与其他种群的个体互动。这些种群根据一种全群体的特征评分，例如在大约40天孵育期后的成虫总数。表现最好的群落（即亲本群体）被选出并用作繁殖新一代群体（即子代群体）的遗传库（图1b, c）。作为对照，一些研究建立了随机选择系（在这些系中，选择用于繁殖的种群是随机选择的，与表型无关），以及无选择系（在这些系中，所有亲本种群都被选择用于繁殖，每个亲本种群都生成一个子代种群）（图1d, e）。

为了生成子代群体，这些研究采用了两种不同的策略。一种繁殖策略称为“繁殖体法”（43）。在这种方法中，从选定的亲本种群中随机挑选出一小部分个体（约10个）引入新栖息地，作为子代种群的接种物（图1b）。第二种繁殖方法称为“迁徙池法”（43）。这种方法将所有选定的亲本种群的动物集中在一起，然后从池中随机挑选一小部分（也是约10个）在新栖息地中生成子代种群（图1c）。

所有这些实验都发现，在种群水平选择的响应下，种群的平均表型发生了显著的定向变化。实际上，这些实验中的元种群（种群的种群）满足了人工选择的两个必要条件。首先，研究人员发现，由于小型、遗传多样的种群和有性重组的结合，选择下的表型在种群之间存在显著的变异。其次，后续研究还表明，这种变异具有可遗传成分，源于特定基因型组合之间的相互作用，这些相互作用直接决定了种群水平选择的特征（例如，成虫个体数）（41, 43）。

### 微生物群落和生态系统的人工选择

在21世纪初，生物体水平以上的人工选择从种群和小型双物种群落扩展到了整个微生物生态系统。在一系列具有里程碑意义的研究中（103, 104），Swenson及其同事采用了繁殖体和迁徙池策略，选择在三种群落水平的突现特征中得分较高的微生物生态系统：（a）生态系统生长的水体介质的pH值；（b）3-氯苯胺（一种水污染物）的集体降解能力；（c）间接的微生物组表型，例如这些群落接种的植物的地上生物量。尽管这些实验显示出希望，但与动物种群中观察到的强烈而显著的响应相比，选择效果较为温和（40, 43, 111, 112）。

这些研究之后，又进行了少量额外的人工微生物组选择实验，所有这些实验采用了相似的方案和选择策略。Panke-Buisse等人（75, 76）使用迁徙池方法，人工选择了土壤微生物组，以诱导不同基因型的拟南芥（Arabidopsis thaliana）和芸薹属（Brassica rapa）植物分别在早期或晚期开花。实验发现，早开花和晚开花选择的微生物组之间的平均开花时间存在显著的相对差异。然而，两条选择线都随着时间的推移漂移，开花时间晚于起始的（未选择的）微生物组。在一项后来的研究中，Blouin等人（15）使用多条人工选择（以及随机选择）线的实验设计，选择了在水生生态系统中低CO2排放的微生物组。人工选择线的呼吸量低于随机对照组，但在两者中，CO2的产生量随时间下降。最近的研究试图选择能够降解细胞外聚合物（18, 121）、保护植物免受干旱（55, 71）、改变动物胚胎发育（8）以及促进某些不能自行生长的物种生长的微生物组（18）。总体而言，我们认为，成功与否参半（有些实验成功，而其他实验失败或结果不明确），且通常效果温和。

### 群落水平人工选择成功的限制因素是什么？

如上所述，群落水平的人工选择要求群落在选择特征上表现出变异，并且这种特征能够可靠地从父代群落传递到子代群落。关于群落水平特征的遗传性，从父代生成子代群落的方法因此至关重要（83）。由于繁殖体和迁徙池策略在动物种群中的成功，这两种方法在我们所知的所有微生物群落水平选择研究中被普遍采用。然而，动物种群和微生物群落之间存在重要的量化差异。首先，微生物群落通常大几个数量级。保守估计，在之前的实验中用于接种每一代的细菌细胞数量约为10^6，而实际数量可能高几个数量级（19）。这种大规模的接种量可能限制随机采样生成群体间大变异的能力，而这种变异是选择作用的关键因素（19）。在动物种群中，有性繁殖和遗传多样性的起始池也确保了群体间的高度变异（图1b）。相比之下，大多数微生物进行无性繁殖（尽管存在水平基因转移的可能），重组通常很少，仅依靠现有的遗传变异产生新基因型的潜力较低。随机性和选择都需要用于有效探索适应性景观（122）。

关于生态系统间的变异，Blouin等人（15）讨论了这种变异与选择之间的冲突。如上所述，选择依赖于表型变异。然而，随着选择的进行，这种变异将耗尽，因为它将不可避免地从元种群中消除等位基因和物种（图2a）。如果没有再生群落间变异的机制（下文将详细讨论），我们应该预期人工选择的收益递减：每轮选择后，可遗传变异的量会减少，导致对选择的响应越来越弱。因此，如果我们希望人工选择在前几轮之外成功，再生这种变异至关重要。下文我们将讨论如何补充这种变异（图2a）。

群落或生态系统水平人工选择的第二个重要限制因素是这些系统固有的动态特性。在大多数人工选择实验中，选择是应用于连续批次培养的群落（图2b）。在没有选择的情况下，连续批次培养开始时，将前一个批次（亲代批次）中的个体接种到新的栖息地，并让这一新批次在理论上相同或尽可能相似的环境中生长。在批次孵育时间t结束时，从子代批次中再次随机抽取细胞接种到另一个栖息地，并继续这一过程（图2b）。在每个批次孵育期间，所有物种都生长并经历生态演替（24, 29, 33）（图2c）。这些演替在亲代和子代批次之间不一定相同，其各自批次孵育结束时的组成也不一定相同（图2c）。如我们在下文所讨论的，也如其他地方所证明的（19），这种世代不稳定性会对遗传性产生不利影响，并严重限制多物种联合体中生态系统水平选择的成功（参见附录：结构-功能景观部分）。

人工选择作为自上而下的工程方法

在关于人工生态系统选择的第一篇论文中，Swenson等人（104）提出了利用人工选择自上而下地工程化微生物群的想法。然而，这项研究和之前的其他研究的主要目标并不是工程化生态系统，而是展示生态系统级别选择的可行性并研究其基本限制。或许正因如此，大多数研究都集中于选择对平均功能的方向性反应，通常是通过与随机选择对照进行比较，并且据我们所知，没有一项微生物群选择实验包括无选择对照。无选择对照本质上是一种生态探查的练习（18）：设置一组多样化的富集群落，让它们在没有混合的情况下稳定下来，最终选择其中最具理想特征的群落。在缺乏性重组的情况下，选择相对于生态探查的优势并不明显，因此生态探查代表了选择策略成功的基准。重要的是，作为自上而下微生物群工程化手段的人工选择的最终目标不是提高元群落的平均功能，而是找到比我们最初开始时最好的微生物群更适应的微生物群（19）。如上所述，在或低于个体水平的定向进化旨在在基因型-表型空间中找到最优点。接下来，我们认为微生物群落的定向进化同样可以被概念化为对生态结构-功能景观的引导探索：即群落组成与群落功能之间的映射（见附录：结构-功能景观一节）。

定向进化作为生态结构-功能景观的引导探索

在描述定向进化如何帮助我们在生态结构-功能景观中寻找具有最佳特性的群落之前，有必要澄清我们所说的生态结构-功能景观的含义，以及它与基因型-表型图谱的区别。这将帮助我们更好地理解在个体水平以上和以下进行的定向进化之间的差异。

微生物群落的动态生态结构-功能景观

就像适应度景观是基因型和表型的映射一样，生态结构-功能景观是群落组成（即群落中所有分类群的丰度向量）与群落特征（或功能）之间的映射（见附录：结构-功能景观一节）。群落组成影响群落的集体功能这一概念在生态学中由来已久（67, 85, 106, 107, 117）。近年来，微生物群落的结构-功能景观被明确形式化（45–47, 94, 95）并通过映射大量不同细菌组合及其一种或多种定量集体级别属性进行组合探索（10, 28, 32, 45–47, 52, 54, 58, 94, 101）。

或许适应度景观与生态结构-功能景观之间最大的实际差异在于，正如上述所描述的，群落组成在一个批次内会发生变化，从接种开始到收获结束。此外，即使在没有群体级选择的情况下，批次内的演替动态在亲代和后代群落中也不一定相同（19）。这意味着群落的状态，即批次孵育结束时物种丰度的向量X，会在几代中发生变化，即使没有进行人工选择（图2c）。最终，群落可能会收敛到一种代际稳定的状态，可以表示为其动态景观中的一个固定点（图3a）。

此时有必要问一下，是否可以期待一个代际稳定的可重复演替状态。早期的工作提出群落组装可能是混乱的，因此由稍有不同初始组成（由于不可避免的随机采样）播种的群落在组成和功能上会随时间而分化（104）。然而，多次重复的富集实验[相当于人工选择实验中的无选择对照（19, 111）]发现群落组装并非混乱（30）：从相同接种物播种的重复栖息地通常采用一组离散的替代（代际）稳定状态（30, 39）。这些实验绘制了自组装群落中稳定状态的吸引盆地，并甚至发现了它们之间的随机过渡（30, 109）。其他关于合成或自下而上群落的研究也同样发现了微生物群落中动态多稳态的证据（4, 20, 23, 36）。由于不同的稳定群落状态包含不同的物种，它们在群落级属性和功能上也可能有所不同（37）。这些研究以及相关的理论工作（26）支持了结构-功能景观不仅仅是一个方便的比喻的观点，尽管它有局限性（见附录：结构-功能景观及上文所述），它仍然是一个实用且有用的工具，有助于我们思考生物系统在个体水平以上的定向进化过程。

微生物群落的定向进化：探索生态结构-功能景观的方法

在群落水平上，定向进化将从创建一组代际稳定的群落库开始，这些群落在选择下的集体群落特征上有所不同。然后选择最适应的群落，用其生成一组近似的组成变体库。这些变体通过连续批量培养进行传播，直到它们代际稳定，然后再从中选择最适应的群落，使该过程可以根据需要重复多次（图3a）。蛋白质和网络工程定向进化发展的关键步骤是发明了基因多样化的方法，使得能够探索系统在选择下的适应度景观（74）。如果我们希望将定向进化应用于微生物群落，我们同样应问如何准确地生成选定群落的组成变体库。在基于富集的方法中，已经有许多想法和方法在自上而下工程化微生物群落的过程中得到实证检验（22, 38, 56, 60, 62, 77, 127）。下面，我们讨论这些以及其他一些可能性（19）。

水平基因转移和移动元素

移动元素可以创造出新菌株，其对群落层面功能的贡献可能与其祖先有所不同（图3a）。这表明，将移动元素（如噬菌体和质粒）添加到一个元群落中的不同群落，可能会随机地导致群落中出现新菌株，从而在群落间产生功能差异。在最近的一项研究中，Quistad等人（78）将移动元素从一个群落转移到另一个群落，这一过程导致了受体物种的遗传变化（如涉及氮代谢的基因扩增）。这些遗传变化与群落层面的功能变化（如氨化生化速率）相关，表明通过刺激物种层面的进化可以作为创建成功群落的组成和功能变体的一种手段。近年来，已经开发出更有针对性的工具，通过水平基因转移将质粒传递到稳定的微生物群中（91）。

合并。在选择的群落中，通过将其与每一个未选择的群落进行合并，可以创建一个该选择群落的变体库（68, 86, 87, 99）（图3b）。多条理论和实证证据表明，将两个群落混合在一起会产生一个新群落，该新群落在组成和功能上都类似于其父群落（99, 105）。

横向迁移。从一个或多个自然物种库中随机抽取的物种可以加入到群落中，以生成近源变体（图3d）。这些入侵物种可能会取代一些常驻分类群，或者通过固定而不使其他物种灭绝来增强群落（61）。即使那些未能固定的物种，也可能在原则上将群落推向另一种状态（4）。

选择性导入。被认为对所选择功能有益的物种可以逐个选择性地加入群落，从而生成组成变体库（图3g）。为了确保加入的物种不会被常驻物种竞争淘汰，可以为其提供一种专属的代谢生态位（即一种加入物种可以利用但入侵群落中大多数成员无法利用的营养物质）（96）。

瓶颈效应。通过对选择的群落施加多次严酷的瓶颈作用，可以生成其变体，这种方法称为稀释至灭绝（22, 35, 53, 56, 62）（图3c）。如果在每次瓶颈过程中从群落中抽取的细胞数量足够少，那么固有的抽样随机性将确保每个变体的群落组成不同（56）。可以通过实验证实最佳瓶颈大小，以最大化组成变体之间的功能变异，因为这与种群大小有关（19, 53）。

选择性剔除或抑制。常驻群落中的个别物种也可以通过选择性剔除或生长抑制来处理，例如通过窄谱抗生素或噬菌体（17, 70, 73, 124）（图3f）。这将创造出具有不同组成的群落变体。此外，噬菌体和抗生素也代表了可以改变群落基因型组成的选择压力，提供了一种额外的机制来生成组成变体（3, 116）。

环境脉冲扰动。除了添加和移除物种之外，还可以通过暂时改变环境将群落推向生态景观的随机方向，例如改变营养成分、增加温度、盐度或pH值，或通过其他手段（图3g）。这将改变群落中所有成员的适应度，使一些稀有成员的丰度增加，而一些较多的成员丰度减少。当环境恢复到正常状态时，受扰动的群落可能由于物种丧失或多稳态性而收敛到不同的固定点。环境脉冲扰动还可能导致微生物群体的表型转换（9）。我们推测，即使在基因型组成没有变化的情况下，细胞记忆也可能使我们能够将微生物群落推向新的功能状态。

环境持续扰动。最后，与上述所有创建组成变体的策略不同的是，另一种可能性是以一种小但永久的方式改变环境，从而创建以前不存在的新稳定状态（60）（图3h）。我们推测，这可能允许对群落组成进行更细致的控制，因为持续扰动可以在原则上变得非常小，从而可能允许物种丰度发生非常微小的变化（60）。

总结。上述方法并不详尽。读者会注意到，用于人工选择的两种方法——繁殖体和混合库——也是探索生态结构-功能景观的手段。瓶颈方法本质上是繁殖体方法的一种极端形式，在这种方法中，选择非常少量的细胞来播种后代。而迁移池方法也是合并的一个例子，其中两个以上的群落以相同比例混合。如果抽取的细胞数量足够少，这两种方法都可以成功创建新的变体库（18）。

微生物群落的定向进化：群落层次的选择和遗传性

在生成了足够异质性的变体库之后，我们必须意识到并非所有变异都是可遗传的。例如，有些变异可能来自于测定每个群落功能时的测量误差。这个不可遗传的成分如何影响选择？群落层次的遗传性量化了群落功能从亲代群落传递到子代群落的程度。如果遗传性非常低，则意味着亲代和子代群落功能之间的相关性较低。因此，高群落层次的遗传性对于定向进化的有效性至关重要。为了理解不同实验和生态过程如何影响这种遗传性，首先让我们考虑在没有人工群落层次选择的情况下传代的一个超群落（图2b），直到所有群落都达到演替稳定状态（详见附录：结构-功能景观一节）。

我们用 fx 和 fy 分别表示亲代群落和其子代群落的实验测定功能。根据假设，这两个群落都处于相同的代际平衡状态 X∗。这两个群落的功能可以表示为：

 f_x = F(X*) + ξx

 f_y = F(X*) + ξy

其中，F(X∗) 表示结构-功能景观中与平衡状态 X∗ 相关的功能，ξx 和 ξy 是均值为零且方差相等的无相关随机变量（σξ2）。这两个变量捕捉了由于漂变（例如，由移液引入的随机抽样）、测量误差、环境波动和其他随机因素导致的群落组成偏离真实平衡状态的小随机偏差的影响。如果我们在整个超群落中对亲代和子代功能进行回归分析，那么回归斜率将由 b = Cov(fx, fy) / σx2 给出，其中 σx2 是在亲代超群落中实验测定的方差。实验测定的方差将由 σx2 = σF2 + σξ2 给出，其中 σF2 代表亲代超群落中不同群落处于不同平衡状态所导致的方差成分，即超群落中 F(X∗) 的方差。

根据假设，每个子代群落都在与其亲代相同的动态平衡状态附近波动。因此，源自不同群落处于不同稳态的方差成分（σF2）将完整地从亲代传递到子代超群落。相比之下，σξ2 是不可遗传的，因为它包括所有在亲代和子代群落之间无关的随机变异来源，从种群动态中的漂变到环境波动或测量误差。由于假设 ξx 和 ξy 无相关，因此 Cov(fx, fy) = σF2。亲代和子代功能之间的回归斜率将等于 b = σF2 / σx2。显而易见，斜率 b 等于亲代超群落中功能总变异中可遗传的部分，即群落遗传性 h2 (15, 42)：

相对于 σF2 而言，σξ2 越大，对选择的响应就越弱。这突出了所有不可遗传成分对于群落层次选择的有害作用。最近已研究了移液误差的影响（123），并强调了精确和准确测量群落层次功能的重要性以及在平衡状态下处理遗传多样性群落的重要性。应避免种群之间的空间和时间环境条件不均匀。

总结与展望

我们撰写此综述的动机是综合总结生物系统在个体层次以上和以下的定向进化之间的异同。正如定向进化已被用于工程蛋白质和微生物菌株一样，它也可以被用于工程群落和生物体。其基本理念相似，但也存在重要的差异。与生物体或分子（其基因型在其生命周期内是稳定的）不同，群落的组成不仅在每一批次的演替过程中发生变化，而且在连续的批次之间也会发生变化。只有在群落稳定之后，其组成和集体特性才能可靠地从亲代群落传递到子代群落。此时，群落才成为一个有效的选择单位，并可以进行定向进化。在这篇综述中，我们讨论了如何进行这样的实验，并提供了一些希望对其他研究人员设计自己的方法有用的想法。