2003年nature上的一篇经典rice gene dicovery paper：

Xueyong Li;Qian Qian;Zhiming Fu;Yonghong Wang;Guosheng Xiong;Dali Zeng;Xiaoqun Wang;Xinfang Liu;Sheng Teng;Fujimoto Hiroshi;Ming Yuan;Da Luo;Bin Han;Jiayang Li；Control of tillering in rice. Nature, 2003, 422(6932): 618-621

 

Tillering in rice (Oryza sativa L.) is an important agronomic trait for grain production, and also a model system for the study of branching in monocotyledonous plants.

解读如何挖掘功能gene，流程如下：

1、获得moc1 突变株（表现出明显的单分蘖性状，即lost 分蘖功能），突变体来自spontaneous mutations or g-ray radiation and ethyl methanesulphonate (EMS）mutagenesis。

2、应用moc1 突变株和Minghui 63 (indica)杂交。获得2,010F2作图群体（A mapping population of 2,010 F2 mutant plants）。

3、初定位：应用280 F2 mutant plants 以及Simple Sequence Length Polymorphism (SSLP) and
Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP) markers进行图谱构建，QTL定位。结果为将moc1基因定位到第6号染色体的R1559与S1437之间。

4、精细定位：在更大的作图群体中应用新开发的分子标记（选择R1559与S1437之间的标记）进行精细定位，（The MOC1 locus was further placed within a 20-kb region between the markers 17-3 and 12-2 by using 2,010 F2 mutant plants and newly developedmolecular markers）。定位的结果为将moc1 定位到20kb左右的区域，在标记17-3和12-2之间。

5、同源gene比较：通过对20-kb的区域的ORF编码蛋白的同源性比较，寻找和tomato中branchless phenotype的gene比较，确定候选的gene。

6、在20kb的范围选择候选的gene，设计引物(5'-TCGTTGTAGTAGCTCT GGTG-3' and 5' -CTAACTAGAGATCGAGTAGC-3' )在moc1 和野生型植株中进行PCR扩增，扩增产物直接测序。

7、DNA测序比较分析显示在moc1突变体ORF区域存在1.9kb的逆转录转座子。通过功能互补研究发现逆转录转座子为导致moc1的原因。

8、构建质粒载体转基因验证：a 3.2-kb wild-type genomic fragment containing the entire ORF plus a 1.5-kb upstream region (pC8247),but not the one carrying a C-terminal truncation (pC8247S) (Fig. 2b), was able to rescue the monoculm phenotype of the moc1 mutant。DNA 杂交显示此ORF即是MOC1 gene。并且在水稻基因组中为单拷贝。

9、应用reverse transcription(RT)–PCR在moc1 幼苗的total RNA中clone 得到moc1 的cDNA。cDNA与基因组DNA比对结果显示MOC1 gene没有内含子，与tomato中的结果一致。在moc1中，1.9kb的逆转录转座子插入的位置948，导致提前终止。

10、同源比较分析moc1为plant-specific GRAS family proteins。GRAS家族蛋白被认为是转录因子，为了检验MOC1是否在核内；应用GFP reporter gene融合到moc1 gene的最后一个密码子上，转基因到水稻中，显示MOC1 is a nuclear-localized protein

11、研究MOC1 在rice tillering中扮演的角色，进行解剖和组织分析。no tiller buds could be observed in the moc1 mutant。In the longitudinal sections of the tip part of wild-type seedlings, tiller buds at different developmental stages could be observed。