纳米气泡热酸稳定性研究

纳米气泡（Nanobubbles, NBs）是尺寸小于 200 nm的气体分散体系，目前在治疗和药物递送领域的研究日益增多，但其稳定性极易受环境条件影响。本研究评估了由氢氧混合气（HHO）和纯氢气（H₂）制备的纳米气泡在热应激和 pH 应激条件下的稳定性：对氢氧混合纳米气泡进行加热（80°C 和 100°C）和冷冻（-17°C）处理，对氢气纳米气泡则在 pH 4-9 的环境中储存 7 天。采用nm颗粒跟踪分析技术（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）测定纳米气泡的粒径（众数、平均数、D50）和浓度。

结果显示，氢氧混合纳米气泡在 100°C 下发生显著降解，表现为浓度降低且粒径增大；冷冻处理则导致其出现中度不稳定性。氢气纳米气泡在中性 pH（6-7）条件下稳定性最佳，能保持粒径和浓度稳定；而在强酸性（pH 4）和强碱性（pH 9）条件下，其颗粒崩解速度加快。综上，中性 pH（6-7）是纳米气泡稳定的最佳条件，而极端温度（100°C 和冷冻）会显著降低其稳定性。本研究结果为设计环境耐受性更强的纳米气泡制剂提供了思路，可推动其在治疗性气体输注、先进药物递送等临床领域的应用。

引言

纳米气泡（NBs）是尺寸通常小于 200 nm的超小气泡，具有独特的物理化学特性，如内部压力高、比表面积大、在液体介质中稳定性优异等 [1]。这些独特性质使纳米气泡在生物医学和治疗领域展现出巨大应用潜力，例如可用作活性物质递送体系、医用气体载体以及再生组织刺激用输注介质 [2]。

然而，纳米气泡的稳定性并非绝对，其很大程度上取决于周围环境条件，尤其是溶液温度和 pH 值。温度变化会增加分子动能并降低表面张力，而极端 pH 值可能改变纳米气泡的表面电荷和界面相互作用。这些因素共同作用，会加速气泡聚并、崩解或气体从纳米气泡颗粒中释放 [3]。因此，了解纳米气泡对环境应激的响应机制，是优化其制剂以适用于临床和制药领域的关键环节。

本研究采用两种主要处理方式 —— 温度处理（包括加热和冷冻）与 pH 处理（pH 4-9），分别评估由两种不同气体（氢氧混合气 HHO 和纯氢气 H₂）制备的纳米气泡的物理稳定性。

选择氢氧混合气（HHO）用于温度处理测试，主要基于其高反应活性以及在热能作用下易解离的特性。HHO 是水电解的产物，属于氧气（O₂）和氢气（H₂）的爆炸性混合气体（常被称为 “布朗气”）。理论上，与单一气体纳米气泡相比，HHO 纳米气泡内部结构可产生更高的压力。这一特性使 HHO 成为评估纳米气泡在沸腾、长期冷冻等极端热应激条件下物理界面抗性的理想模型体系。当温度升高或水结冰时，HHO 气泡内部气体产生的压差预计会发生更显著变化，从而揭示纳米气泡体系的物理稳定性极限 [4]。

与之相反，选择纯氢气（H₂）作为 pH 稳定性测试的模型气体，是因其具有惰性、分子体积小且不与氢离子（H⁺）或氢氧根离子（OH⁻）发生反应的特性。这一特性可避免气体对溶液化学变化产生干扰，确保观察到的纳米气泡粒径或浓度变化仅由 pH 效应引起，而非气体反应。此外，医学文献中广泛认可氢气分子作为治疗性气体的价值，其具有显著的抗氧化和抗炎特性，且在各类临床前研究中被广泛用于输注治疗 [2,5]。因此，评估氢气纳米气泡在生物 pH 范围和极端 pH 范围内的稳定性，是验证其在安全、精准医用气体递送体系中应用潜力的重要步骤。

为评估温度和 pH 处理对纳米气泡物理参数的影响，本研究采用nm颗粒跟踪分析技术（NTA）进行测定。该技术可直接监测溶液中颗粒的粒径分布（众数、平均数、中位数）和颗粒浓度。通过这一方法，本研究旨在为确定维持纳米气泡物理稳定性的最佳参数提供坚实的科学依据，支持耐环境变化的纳米气泡基制剂研发，并为其在气体治疗、再生医学及纳米气泡药物递送体系中的应用开辟新方向。

方法

材料

温度处理实验采用在反渗透（RO）水中制备的氢氧混合纳米气泡（HHO）溶液；pH 处理实验采用在反渗透水中制备的氢气纳米气泡（H₂）溶液。为在样品制备和分析过程中维持 pH 稳定，使用由 1% 抗坏血酸和 1% 碳酸氢钠组成的缓冲液。在通过nm颗粒跟踪分析（NTA）进行检测前，采用磷酸盐缓冲盐水（PBS）作为稀释剂，以确保颗粒浓度处于仪器检测范围内。此外，十二烷基硫酸钠（SDS）和去离子水（Water One）用作冲洗液，在每次测量前后清洁 NTA 仪器，防止样品间交叉污染。所有材料均在无菌条件下制备，并严格遵循实验室操作规程，以保证研究数据的准确性。

实验设计

氢氧混合纳米气泡（HHO）的温度与冷冻处理

本研究通过四种不同条件处理氢氧混合纳米气泡（HHO NB）样品，以评估温度处理对纳米气泡物理化学特性的影响。四个样品组具体如下：

l RO 组：制备后未进行任何额外处理的样品（基线组）；

l RO T80C 组：在 80°C 下加热 10 分钟的 HHO 纳米气泡样品；

l RO T100C 组：在 100°C 下加热 10 分钟的 HHO 纳米气泡样品；

l RO FREEZE 组：在标准冰箱（约 - 17°C）中冷冻 192 小时（8 天）的 HHO 纳米气泡样品。

氢气纳米气泡（H₂）的 pH 处理

使用 1% 抗坏血酸溶液和 1% 碳酸氢钠溶液将氢气纳米气泡（H₂ NB）样品调节至目标 pH 值（4-9）。所有样品均在冷藏条件（约 4°C）下储存 0 天、1 天、3 天、5 天和 7 天。

表 1 氢气纳米气泡溶液处理用 pH 缓冲液组成

表 1 列出了制备特定目标 pH 值（pH 4 至 pH 9）溶液时所用 1% 抗坏血酸和 1% 碳酸氢钠的体积变化。每种溶液均以氢气纳米气泡水为溶剂，制备成总容积固定为 20 毫升的体系，并调节至所需 pH 值。表中还包含描述性标注，对各混合体系的酸碱性强度进行分类。

测定参数

所有经温度处理和 pH 处理的纳米气泡，其特性均采用基于nm颗粒跟踪分析（NTA）技术的 NanoSight Pro 系统（英国马尔文帕纳科公司）进行测定。分析在室温下进行，通过珀尔帖模块精确控温，并采用小体积流通池（LVFC）确保流动稳定和检测准确。所用仪器为 NS XPLORER（马尔文帕纳科公司），配备 405 nm紫色激光，用于检测nm级颗粒。

分析前，所有样品均用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释 50 倍，以确保颗粒浓度处于最佳检测范围。测定参数包括众数粒径（主要粒径）、平均粒径、D50（中位直径）和颗粒浓度（颗粒 / 毫升）。根据所观察颗粒的类型优化相机参数（如增益、快门速度、激光强度），并考虑稀释倍数进行调整。测量设置如下：每个样品捕获 5 次，温度控制在 25°C，每次捕获 3000 帧，流速为 30 微升 / 分钟。每个样品进行 5 次平行分析，以获取平均值和标准差，从而提高数据有效性并最小化测量误差。

结果

氢氧混合纳米气泡（HHO）的温度与冷冻处理

表 2 列出了反渗透（RO）水中制备的纳米气泡，经高温处理（80°C 和 100°C）和冷冻处理后的粒径与浓度分析结果，测定参数包括众数粒径、平均粒径、标准差、粒径分布（D10、D50、D90）和颗粒浓度。数据显示，温度变化会导致纳米气泡的粒径和浓度发生改变，高温处理总体上会使平均粒径增大、颗粒浓度降低。

表 2 氢氧混合气（HHO）制备的纳米气泡在温度与冷冻处理下的特性

图 1 展示了不同温度处理下纳米气泡平均粒径和中位粒径（D50）的变化。数据清晰显示，100°C 加热会显著增大颗粒粒径；而与对照组相比，80°C 加热会使平均粒径和中位粒径均减小；冷冻处理则导致颗粒粒径较未处理样品出现中度变化。

图 2 展示了氢氧混合纳米气泡在不同热条件处理后的浓度变化。结果表明，100°C 加热会显著降低颗粒浓度；而 80°C 加热和冷冻（-17°C，8 天）处理后的颗粒浓度与对照组相近。

氢气纳米气泡（H₂）的 pH 处理

本部分评估了 pH 值变化对氢气纳米气泡（H₂）的影响。将样品调节至目标 pH 值（4-9）并储存 7 天，观察其粒径分布和浓度变化。结果揭示了酸性、中性和碱性环境对纳米气泡稳定性的影响，为确定维持颗粒完整性和功能性能的最佳条件提供了依据。

表 3 pH 4 溶液中纳米气泡在 7 天储存期内的粒径与浓度变化

表 4 显示，在 pH 5 条件下，整个储存期内纳米气泡的粒径逐渐增大、浓度逐渐降低。尽管其降解速度不如 pH 4 条件下快，但这些结果表明，中度酸性环境仍会对纳米气泡稳定性产生渐进式影响，此 pH 条件可视为纳米气泡向更稳定状态过渡的阶段。

表 4 pH 5 溶液中纳米气泡在 7 天储存期内的粒径与浓度变化

表 4 pH 5 溶液中纳米气泡在 7 天储存期内的粒径与浓度变化

表 5 显示，在 pH 6 条件下，直至第 7 天，纳米气泡的粒径（众数和平均数）仍保持稳定，且颗粒浓度维持在较高水平。这表明 pH 6 是维持纳米气泡结构完整和数量稳定的相对最佳区间，环境离子对其界面的破坏作用最小。

表 5 pH 6 溶液中纳米气泡在 7 天储存期内的粒径与浓度变化

表 6 显示，在 pH 7（中性）条件下，纳米气泡的粒径和浓度均趋于稳定，波动幅度极小。其众数粒径始终维持在 82.5 nm 左右，浓度则呈缓慢下降趋势，这表明 pH 7 是纳米气泡短期稳定的最佳条件。

表 6 pH 7（基准）溶液中纳米气泡在 7 天储存期内的粒径与浓度变化

表 7 显示，在 pH 8（弱碱性）条件下，纳米气泡的粒径保持相对恒定，且颗粒浓度在第 5 天前均维持稳定。这表明该条件下纳米气泡具有较好的稳定性，尽管在储存期即将结束时，浓度开始呈现下降趋势。

表 7 pH 8 溶液中纳米气泡在 5 天储存期内的粒径与浓度变化

表 8 显示，在 pH 9（中度碱性）条件下，纳米气泡的粒径虽出现轻微波动，但整体仍处于稳定范围。从第 5 天到第 7 天，颗粒浓度略有下降，这表明该条件下纳米气泡存在长期不稳定的中度潜在风险。

表 8 pH 9 溶液中纳米气泡在 5 天储存期内的粒径与浓度变化

图 3 显示，在某些 pH 条件下，纳米气泡的主要粒径（众数粒径）呈增大趋势，这表明氢离子（H⁺）对气泡界面的破坏导致了团聚现象。与之相反，pH 6 和 pH 7 条件下的众数粒径始终稳定在 82.5 nm 左右，是最适宜的条件。pH 5、pH 8 和 pH 9 条件下则出现轻微波动，反映出这些条件下纳米气泡处于过渡状态，或受到中度离子胁迫，从而影响其稳定性。

图 4 显示，强酸性环境（pH 4 和 pH 5）导致纳米气泡的平均粒径显著增大，这表明氢离子（H⁺）破坏气泡界面，引发了团聚或聚并现象。相反，pH 6 和 pH 7 条件下，纳米气泡的粒径保持相对较小且稳定，说明中性环境下其稳定性最佳。在碱性环境（pH 8-9）中，粒径波动较小，但仍呈现出稳定性逐渐下降的趋势。

图 5（原文表述为 Figure 3，推测为笔误）显示，pH 4 条件下，直至第 5 天，纳米气泡的 D50（中位粒径）均显著增大，表明强酸性条件下气泡发生了明显团聚。而 pH 6 和 pH 7 条件下，D50 始终维持在较低水平且保持稳定，体现出均匀稳定的粒径分布。同时，pH 5、pH 8 和 pH 9 条件下 D50 出现轻微波动，反映出这些条件下纳米气泡处于过渡状态，或其界面受到中度干扰。

图 6 显示，pH 4 和 pH 5 条件下纳米气泡浓度下降最为显著，表明强酸性环境下气泡快速崩解。相反，pH 6 和 pH 7 条件下浓度始终维持在较高水平且保持稳定，说明中性环境最有利于纳米气泡的稳定。在 pH 8 和 pH 9 条件下，浓度呈逐渐下降趋势，反映出氢氧根离子（OH⁻）对纳米气泡具有长期破坏稳定性的作用。

值得关注的是，印度尼西亚分子研究所（IMI）此前已成功制备出基于氢氧混合气（HHO）的纳米气泡，其浓度高达 2.99×10¹⁰颗粒 / 毫升，远高于本研究中观察到的浓度范围。这一成果凸显了本地技术在制备高密度纳米气泡制剂方面的巨大潜力 —— 理论上，此类高密度纳米气泡可提高活性物质的递送效率，并增强其在临床和再生医学应用中的稳定性。

讨论

本研究结果明确表明，纳米气泡（NBs）的物理稳定性主要受两个因素影响：一是制备纳米气泡所用的气体类型，二是外部环境条件（尤其是溶液温度和 pH 值）。这些因素直接影响纳米气泡在储存过程中的粒径、粒径分布以及在溶液中保持的浓度。

在以氢氧混合气（HHO）制备的纳米气泡组中，高温暴露对纳米气泡的物理完整性产生了显著影响。具体而言，加热至 100°C 时，纳米气泡的平均粒径和中位粒径均大幅增大，同时颗粒浓度急剧下降。这一现象最可能的原因是：温度升高使分子动能增加，导致纳米气泡内部体积膨胀，进而促进颗粒聚并，最终造成气泡破裂、内部气体释放。这一过程会加速气体向周围环境扩散，减少体系中可检测到的纳米气泡数量 [6]。与此同时，在 - 17°C 下冷冻 8 天也导致纳米气泡浓度下降和粒径变化，这可通过冰晶形成造成的物理破坏来解释 —— 冰晶可能会破坏纳米气泡的界面结构，使其保护层受损，从而丧失维持内部压力的能力。

与之相反，以纯氢气（H₂）制备的纳米气泡对 pH 值变化表现出更强的耐受性，尤其在中性 pH 范围（6-7）内。在此条件下，纳米气泡的各项物理参数（包括众数粒径、平均粒径和中位粒径）在 7 天储存期内始终保持稳定，颗粒浓度也维持在较高水平。这表明中性环境使纳米气泡的界面张力与静电斥力达到最佳平衡，从而维持了其结构完整性和均匀分布。这些发现与以往研究报道 [7,8] 一致，即纳米气泡在生理 pH 范围内稳定性最高。

在强酸性条件（pH 4）下，随着储存时间延长，纳米气泡粒径急剧增大，且从第 1 天起浓度就大幅下降。这反映出气泡发生了快速崩解，而这很可能是由高浓度氢离子（H⁺）引发的 —— 氢离子与纳米气泡的界面层相互作用，破坏其表面稳定性，进而促进气体释放和颗粒聚并 [9]。在 pH 5 条件下，尽管纳米气泡的降解速度不及 pH 4 条件下快，但仍存在明显的粒径波动和浓度下降趋势，表明该 pH 值是纳米气泡向最佳稳定状态过渡的区间。

在碱性环境（pH 8-9）中，纳米气泡表现出中度稳定性：粒径虽有轻微波动，但从第 3 天到第 7 天，颗粒浓度开始逐渐下降。这可能是由于氢氧根离子（OH⁻）影响了纳米气泡的界面张力和表面电荷分布 —— 随着时间推移，这种影响会降低纳米气泡的内部压力，加速气体从颗粒中扩散出去。

总体而言，这些发现表明，pH 6-7 是维持液体介质中纳米气泡粒径和浓度稳定的最佳范围。这一点在治疗应用中尤为重要，特别是当纳米气泡用作活性物质或医用气体的载体时，往往需要具备中短期稳定性。极端环境条件下纳米气泡稳定性下降的现象表明，用于医疗领域的纳米气泡制剂在研发过程中，必须同时考虑储存环境和生理环境的影响。

未来，本研究结果为进一步探索纳米气泡技术开辟了方向，例如添加稳定剂、进行表面包覆，或研发具有核壳结构的纳米气泡，以增强其对环境变化的耐受性。此外，在印度尼西亚本地生产背景下，这些发现为开发更标准化的基于氢氧混合气（HHO）和氢气（H₂）的纳米气泡技术提供了重要科学依据，助力此类技术在临床和再生医学治疗中实现应用。

本实验评估了由氢氧混合气（HHO）和氢气（H₂）两种气体制备的纳米气泡在热处理、冷冻处理和 pH 值变化条件下的稳定性。通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）获得的结果显示，不同处理方式对纳米气泡的粒径参数（众数、平均数、中位数 / D50）和颗粒浓度产生了不同影响，这些差异反映了纳米气泡在水介质中的物理稳定性。选择氢氧混合气用于热处理实验、选择氢气用于 pH 值评估实验，主要基于两种气体的物理特性以及实验室体系中气体的可获得性：氢氧混合气是通过水电解产生的氧氢混合物，可大量制备，且在极端温度测试中具有更高稳定性；而纯氢气被用于 pH 值研究，则是因其作为一种氧化还原治疗剂，对环境条件较为敏感，适合用于评估不同 pH 环境下的稳定性。总体而言，本研究表明，纳米气泡的稳定性高度依赖于环境处理条件，其中气体类型的选择和外部环境条件是维持其功能有效性的关键因素。

在氢氧混合纳米气泡实验中，暴露于 80°C 和 100°C 等高温环境会导致颗粒浓度显著下降，100°C 时尤为明显。将样品煮沸 10 分钟后，可检测到大量纳米气泡消失，具体表现为浓度降低且平均粒径增大。这一现象推测是由于高温下分子动能增加，引发气体膨胀和颗粒聚并，最终导致气泡破裂、气体释放到空气中。在冰箱温度（约 - 18°C）下冷冻 8 天，同样会导致纳米气泡稳定性下降，具体表现为粒径增大、浓度降低。冰晶的形成可能会扭曲并破坏纳米气泡的界面层，导致其内部包裹的气体结构永久损坏。作为对照的常规反渗透（RO）水处理样品（未添加纳米气泡）则保持相对稳定，而经过加热处理的反渗透水（不含纳米气泡）仍表现出更大的粒径和更低的浓度，这进一步证实了纳米气泡结构对热应力和冷冻应力具有高度敏感性。

结论

本研究表明，纳米气泡（NBs）的物理稳定性高度依赖于制备所用的气体类型及环境条件（尤其是温度和 pH 值）。研究发现，基于氢氧混合气（HHO）的纳米气泡对热处理和冷冻处理较为敏感：加热至 100°C 或冷冻 8 天后，其颗粒浓度显著下降，粒径明显增大。这些结果表明，极端温度会通过引发纳米气泡膨胀、聚并和崩解等机制，加速其结构降解。

与之相反，基于氢气（H₂）的纳米气泡在 pH 6-7 范围内表现出稳定性能：在 7 天孵育期内，其粒径和浓度均保持相对恒定。强酸性（pH 4）和强碱性（pH 8-9）条件则会导致纳米气泡的粒径和浓度稳定性下降，这表明极端环境条件会破坏纳米气泡的界面张力和表面电荷平衡。

因此，可得出结论：中性 pH（6-7）是维持液体介质中纳米气泡稳定性的最佳区间，该条件非常适合用于研发输注制剂或基于纳米气泡的活性物质递送系统。本研究为医用纳米气泡的应用提供了重要科学依据，并为通过先进制剂工程开发更耐环境变化的纳米气泡技术开辟了新的可能。