编辑总结

生物组织的光学成像受到光的散射和（较小程度上）吸收的限制，这些因素限制了穿透深度。欧等人通过一种初看起来可能违反直觉的方法解决了这个问题：引入高度吸收的分子（参见Rowlands和Gorecki的观点）。作者展示了添加在近紫外和蓝色区域吸收的常见染料分子可以改善附近较长波长的光学透明度。本质上，通过在蓝色区域造成尖锐吸收，可以在不增加吸收的情况下提高光谱红色部分的折射率。添加酒石黄能够使活体啮齿动物的皮肤暂时透明。——Marc S. Lavine

结构摘要

引言

试图成像生物物质的一个挑战是其复杂结构由于不希望的光散射而引起不透明。这种散射源于生物组织成分之间的折射率不匹配，限制了光学成像的穿透深度。看到生物组织内部并揭示生命的基本过程的愿望激发了对深部组织光学成像方法的广泛研究，例如双光子显微镜、近红外-II荧光成像和光学组织清除。然而，这些方法要么缺乏足够的穿透深度和分辨率，要么不适合活体动物。因此，在活体动物中实现光学透明度的能力有望改变许多光学成像技术。

理由

我们假设强烈吸收的分子可以在活体生物组织中实现光学透明度。通过应用Lorentz振荡子模型来描述组织成分和吸收分子的介电性质，我们预测，在近紫外光谱（300到400纳米）和可见光谱的蓝色区域（400到500纳米）具有尖锐吸收共振的染料分子，当溶解在水中时，能有效提高较长波长下水介质的实部折射率，这与Kramers-Kronig关系一致。结果，水溶性染料可以有效减少水和脂质之间的折射率对比度，导致活体生物组织的光学透明度。

结果

根据我们的理论，我们发现美国食品药品监督管理局批准的一种常见食品色素——酒石黄的水溶液，具有可逆地使活体啮齿动物的皮肤、肌肉和结缔组织透明的效果。我们在组织模拟散射水凝胶和离体生物组织中进行了实验。这些测试证实了我们观察背后的机制，并通过毫米级散射介质展示了一旦获得透明度后可实现的空间分辨率达到微米级别。通过使用吸收性染料分子，我们可以将活体小鼠通常不透明的腹部转变为透明介质。这个“透明腹部”允许直接观察荧光蛋白标记的肠神经元，捕捉它们反映活体小鼠肠道运动的运动。这使我们能够生成描绘小鼠肠道运动和运动模式多样性的时间演化图。为了证明这种方法的普遍性，我们还在小鼠头部的头皮上局部应用染料溶液以可视化脑血管，以及在小鼠后肢上进行高分辨率显微镜成像以观察肌肉肌节。

结论

总的来说，我们报告了一个违反直觉的观察结果，即强烈吸收的分子可以在活体动物中实现光学透明度。作为这一不寻常观察基础的Lorentz振荡子模型预测，具有低共振频率（长吸收波长）、尖锐吸收峰和丰富的离域电子的分子比传统的光学清晰剂更有效地提高水介质的折射率。我们的方法还为无需手术移除或用透明窗口替换覆盖组织即可观察深层组织和器官的结构、活动和功能提供了机会。这种方法仍然存在一些局限性，包括由于异质组织中折射率匹配的挑战而减少但未消除的散射，以及取决于吸收分子扩散的可实现穿透深度。

在活体小鼠中通过吸收性染料分子实现光学透明度。

溶解在水中的强吸收分子可以通过Kramers-Kronig关系修改水介质的折射率，以匹配脂质的折射率。这种方法可以使各种样本变得透明，包括散射体、鸡胸肉组织和活体小鼠身体，用于观察广泛的深层结构和活动。比例尺，5毫米。

摘要

光学成像在生物学和医学中扮演着中心角色，但受到活体组织中光散射的阻碍。我们报告了一个违反直觉的观察结果，即强吸收分子可以在活体动物中实现光学透明度。我们探索了这一观察背后的物理原理，并发现当强吸收分子溶解在水中时，它们可以通过Kramers-Kronig关系修改水介质的折射率，以匹配高折射率组织成分（如脂质）的折射率。我们已经证明，我们的简单方法可以可逆地使活体小鼠身体透明，以允许观察广泛的深层结构和活动。这项工作表明，寻找高性能光学清除剂的研究应该集中在强吸收分子上。

生物物质的复杂结构由于不希望的光散射和吸收而导致不透明，这限制了光学成像的穿透深度（1, 2）。在大多数组织中，散射系数比吸收系数大10到1000倍（2, 3）；因此，散射过程可以严重限制传统显微镜中的成像深度和空间分辨率（4）。如果能显著减少光散射，这将极大增强亮场、荧光、非线性和超分辨率成像技术。

组织中的光散射源于低折射率（RI）水基成分（如间质液和细胞质）与高RI脂质和蛋白质基成分（如质膜、髓鞘和肌原纤维）之间的差异。现有减少RI差异的方法通常用水替代高RI化学物质或去除脂质以产生全水环境（5–8）。尽管这些方法取得了成功，但由于涉及使用有毒物质（如四氢呋喃（8）和丙烯酰胺（6））以及移除对维持生命至关重要的分子（如水和脂质），这些方法很少用于活体组织。

我们报告了一个违反直觉的观察结果，即强吸收分子可以在活体生物组织中实现光学透明度。具体来说，我们发现美国食品药品监督管理局批准的一种常见食用色素——酒石黄的水溶液，具有可逆地使活体啮齿动物的皮肤、肌肉和结缔组织透明的效果。我们探索了这一现象背后的物理原理。应用Lorentz模型对材料的介电特性进行建模，我们将酒石黄以及其他吸收分子建模为Lorentz振荡子（9）。我们的理论模型揭示了，在可见光谱（400到750 nm）中具有尖锐吸收共振的Lorentz振荡子在溶解于水中时非常有效地提高了红色和红外光谱部分的实部折射率，这与Kramers-Kronig关系一致（10, 11）。结果，可见光谱中的水溶性染料可以有效减少水和脂质之间的RI对比度，导致活体生物组织的光学透明度。我们通过在高度散射的组织模拟体和解剖的鸡胸肉中验证了使用可见染料诱导光学透明度的有效性。这种方法与之前关于吸收增强分辨率的报告（12, 13）根本不同。具体来说，我们研究中观察到的光学透明度并非源于染料分子对散射光子的吸收，而是源于组织中减少的散射事件。

吸收性分子使活体小鼠的皮肤和肌肉透明

酒石黄是一种黄色到橙色的水溶性单偶氮化合物，因其在光谱的蓝色区域具有高吸收率而作为食品制造中的常见合成色素（14）。它是一种吸湿性化合物，在水中具有高溶解度且反应性极小。欧洲食品安全局（EFSA）已得出结论，这种分子在每千克体重剂量高达2克时未表现出不良效应或系统性毒性（14）。因此，它被广泛用作风味薯片等产品中的人造食品染料（例如多力多滋）。当溶解在水中时，酒石黄溶液显示出其特有的黄色到橙色（图1A），因此其常用名为“FD&C Yellow 5”。酒石黄溶液的紫外-可见（UV-vis）吸收光谱显示两个主要峰位于257和428纳米，但在~600纳米以上几乎没有吸收（图S1，A和B）。我们通过质谱验证了本研究中使用的酒石黄的化学组成（图S2）。

图1. 吸收性分子使活体小鼠光学透明。

(A) 照片显示引入吸收性分子后散射介质的光学透明度增加。从左到右，前三个1厘米的比色皿分别包含纯水、0.6 M甘油溶液和0.6 M酒石黄溶液。其他三个比色皿含有作为散射体的胶体二氧化硅颗粒，分散在前文提到的三种溶液制备的水凝胶中。（B）图(A)所示样品的透射光谱。（C）使头皮透明的示意图。（D）局部应用前的脱毛小鼠头皮照片。（E和F）激光散斑对比成像的小鼠头部图像（E）局部应用前和（F）局部应用后。（插图）去除头皮后的同一小鼠头部的激光散斑对比成像。比例尺（D）至（F），5毫米。（G）使腹壁透明的示意图。（H至J）小鼠腹部的白光照片（H）局部应用前和（I）局部应用后，（J）识别主要的腹部器官。比例尺（H）和（I），5毫米。（K）使后肢透明的示意图。（L至N）小鼠胫骨前肌的SHG图像（L）局部应用前和[(M)和(N)]局部应用后。（N）M图中红色虚线框的数字放大。（插图）每幅图像的快速傅里叶变换。比例尺（L）至（N），50微米。

我们首先展示了一种染料溶液能够消除含有胶体二氧化硅（折射率=1.43）颗粒分散在水中的不透明悬浮液中的散射。具体来说，0.6 M酒石黄溶液使这个原本不透明的介质在可见光谱的红色区域实现了完全的光学透明。相比之下，传统的光学清除剂（OCAs）如甘油——已被证明可以适度减少体内的散射（15, 16）——在相同的浓度下无法在这个散射介质中达到相同的透明度（图1，A和B）。我们假设吸收性染料可以通过抑制生物结构固有的散射来实现活体组织的光学透明。

我们将酒石黄溶液局部应用于剃毛活体小鼠头部的头皮上，并使用激光散斑对比成像（LSCI）来观察头部的脑血管（图1C）。LSCI通常需要移除头皮，因为其不透明（17），并且对剃毛小鼠头部的成像并未揭示任何脑血管的有趣特征（图1，D和E）。相比之下，应用酒石黄溶液后，LSCI揭示了代表脑血管的结构（图1F和图S3及S4）。为了确认这些血管在大脑中的位置，我们在移除头皮后进行了LSCI，识别出类似的结构（图1F，插图）。除了酒石黄外，一些其他吸收性分子也展示了相似的头皮透明度（材料和方法及图S5）。通过用水冲洗可以从头皮上移除局部应用的染料分子，有效且可重复地逆转透明度效果（图S6）。除了局部应用外，将染料分子注射到头皮中也能产生类似的LSCI图像（图S7），为在较厚皮肤中实现组织透明提供了另一种方法。

接下来，我们试图证明吸收性分子在小鼠腹部实现组织透明度的能力。特别是，当酒石黄溶液局部应用于麻醉下的活体小鼠的腹部皮肤并轻轻按摩时（图1，G和H），腹部皮肤不仅颜色变暗，而且在红色窗口中变得更加透明（图S8）。这种透明度效果可以用肉眼直接观察到，无需任何专门的成像设备。一些吸收性分子已被证明可以使小鼠腹部透明（材料和方法部分）。透明的腹部使我们能够直接观察到内部器官，包括肝脏、小肠、盲肠和膀胱（图1，I和J）。此外，我们还能辨别它们的运动，如蠕动，以及与心跳和呼吸同步的运动（视频1和2）。通过用水冲洗和按摩皮肤可以实现所获得的腹部透明度逆转（图S8）。

电影1. 实时视频展示了小鼠腹部的光学透明度，使腹腔器官可视化。

电影2. 实时视频显示了通过透明腹部观察到的活体小鼠肠道的运动。白色箭头指示盲肠的蠕动。

我们试图通过局部应用酒石黄溶液来展示深层组织的显微成像。我们选择了小鼠后肢的肌节作为成像目标，因为它们在肌肉功能中起着核心作用，并且与神经肌肉疾病（如脊髓性肌萎缩症）有关（18）。现有的体内肌节成像方法需要将微内窥镜侵入性地植入肌肉组织内，以允许从肌节中的肌凝蛋白杆收集二次谐波生成（SHG）信号，在这种情况下，视野受到植入位置的限制（19）。在我们的实验中，我们将酒石黄溶液局部应用于小鼠的后肢（图1K和图S9）。尽管直接通过完整皮肤的SHG成像[激发（Ex），1040 nm；发射（Em），520 nm]在约220 μm的深度揭示了不清晰的显微特征（图1L），但与酒石黄接触的皮肤变得明显透明，使我们能够在相同深度通过收集SHG信号识别肌节的周期性结构（图1，M和N，以及图S10，A至F，S11和S12）。特别是，图S11中的图像是在较高的激发数值孔径（NAs）0.5和0.8下拍摄的，确认我们的方法与高分辨率显微镜兼容。通过透明后肢组织在肌原纤维中识别出的特征周期性为2.60 ± 0.28 μm（图S10，G和H），对应于肌节的长度。SHG图像中的平均周期性与报道的肌节长度一致（19），从而证实了酒石黄能够使组织透明并解析肌肉中的显微特征。

吸收分子在活体组织中实现光学透明的物理机制

尽管酒石黄在光谱的紫外和蓝色区域的吸收很强，但在溶液中它在600 nm以上的吸收仍然最小，即使浓度高达0.78 M（图S1）。在≥600 nm光谱中的高透射率与我们观察到的组织透明度主要在红色波长中实现相符合。因此，我们推测所观察到的透明度源于在表现出透明度的波长更短的波长处增加的吸收。

我们假设具有强吸收和优异溶解度的染料分子可以在溶解后立即增加水的折射率（RI）在波长上的增长。我们通过连接材料折射率实部（n′）和虚部（n′′）光谱依赖性的Kramers-Kronig关系式（11）

其中λ是光的波长，P.V.表示积分的柯西主值。这个方程表明，染料的光谱位置、光谱宽度和吸收强度都是控制可实现n′(λ)变化的参数。作为一个数值例子，通过溶解具有高斯吸收峰（中心在428 nm，半高全宽（FWHM）为94 nm，峰值吸收系数μa = 4πn′′λ−1 = 0.015 nm−1，对应于n′′ = 0.5的值）的酒石黄分子，可以在可见光谱中实现溶液n′的实质性变化（在0.1的数量级上）（图2A）。结果，水溶液的n′在λ > 428 nm时大幅增加，达到脂质和胶原纤维的水平（n′ = 1.43至1.53）（2）。即使在n′′基本上返回到零且吸收可忽略不计的波长处（例如，>800 nm），n′仍高于纯水（n′ = 1.33）。可实现的n′变化与n′′的增加成正比（图S13），因此表明水溶性染料分子在溶解后在长于吸收波长的波长上有效增加水介质的n′。

图2. 通过吸收分子实现光学透明的物理机制。

（A）数值模拟显示，通过引入在428 nm处具有n″峰值（灰色虚线）的吸收分子，调节水溶液的实际折射率指数（n′；绿色实线）。还显示了水的n′（蓝色实线）和高折射率（RI）细胞组分（如脂质和胶原纤维）的n′。 （B）虚部n″和（C）从洛伦兹振子模型计算得出的折射率指数变化Δn′，其共振频率ω0分别位于100 nm（蓝色）、250 nm（绿色）和400 nm（红色）。 （D）甘油（蓝色）、安替比林（绿色）和酒石黄（红色）溶于水的摩尔吸收α和（E）摩尔n′变化β。甘油在250 nm以下的数据来自（51）；酒石黄的全部范围椭偏仪数据如图S14所示。 （F）使用椭偏仪测量不同浓度的酒石黄溶液的折射率虚部n″。 （G）在430 nm处n″对摩尔浓度的依赖性。虚线表示数据的线性拟合，从中提取摩尔吸收α。 （H）使用椭偏仪测量不同浓度的酒石黄溶液的折射率实部n′。 （I）在500、600、700和800 nm处n′对摩尔浓度的依赖性。虚线表示每条曲线的线性拟合，从中提取斜率代表每个波长下的摩尔n′变化β。 （J）以1 mm光程长度测量不同浓度下酒石黄溶液的透射率T，尽管在500 nm以下有强吸收，但显示出600 nm以上仍有透射窗口。 （K和L）（K）最大摩尔吸收α和（L）最大摩尔n′变化β对波长的依赖性，针对甘油、安替比林以及表2中列出的21种吸收分子。 （M）可见光谱内不同染料分子的平均摩尔吸收α与平均摩尔n′变化β之间的关系。用红色虚线圈出的酒石黄标记为染料4。由于感兴趣的波长范围内β值较大，未显示染料21。 （N）不同吸收分子的摩尔n′变化与摩尔吸收之比（β/α）。 “白色窗口”指示具有足够的Δn′和最小吸收的潜在透明光谱。

这些发现与已报告的效果一致，显示当溶解或分散在其中时，吸收分子可以增加介质的折射率。例如，已显示水溶性食品染料（如亮蓝、阿罗拉红、吡喃黄和喹啉黄）在溶解时可大幅改变水溶液的折射率（20）。同样，植物色素（如叶绿素、类胡萝卜素和花青素）在分散到其基质中时可以增强市售聚合物的折射率（21）。此外，注意到苏木精和伊红染色剂会改变细胞内组分的折射率（22）。然而，这些研究都没有探索利用吸收分子减少其系统中的散射，更不用说在体内实现组织透明（图1）。除了这些“折射率工程”研究外，观察结果显示苹果皮中天然存在的强吸收色素可以通过改变折射率影响光散射（23）。这项研究没有主动使用苹果皮色素来改变光学性质，而是强调自然如何使用Kramers-Kronig关系。

优化染料分子的光谱性质将使得在既低又生理上可容忍的浓度下实现光学透明成为可能。为此，我们使用具有单个光学共振的洛伦兹模型模拟了染料分子的光学行为（9）。我们展示了具有多个吸收峰的分子的多振子洛伦兹模型可以简化为单振子模型（补充文本1）。通过这个模型，我们可以直接将OCA的相对电容率εr（和复折射率

）与其等离子体频率ωp和阻尼常数γ

联系一起，其中ε∞是高频介电常数，γ大约等于共振峰的全宽半最大值（FWHM）。选择操作频率ω接近共振频率ω = ω0 − Δω，可将表达式简化为

方程3揭示了一些决定吸收分子提高其所溶解介质n′效力的因素。首先，鉴于ω0−1的比例关系，具有低共振频率（小ω0）的吸收分子在提高介质n′方面更有效。战略性地选择略高于成像所用频率的共振频率（一个较小的正值Δω）也很重要。这确保了在不造成有害吸收量的情况下，由于共振而获得最大的电容率增加。由于光学成像通常在可见光谱中进行，这些要求表明，与那些在近紫外（NUV；300至400 nm）及更短波长处具有吸收峰的染料相比，具有蓝色区域吸收峰的染料作为OCA更有效。其次，吸收分子应具有低阻尼常数γ，这在其吸收光谱中反映为具有小FWHM的窄峰。方程3预测，具有尖锐吸收峰的染料分子充当更强烈的洛伦兹振子，在其共振附近具有更大的εr值。我们还希望避免由于成像波长处的大量吸收而导致的实质性衰减。对于这项工作中考虑的强吸收染料，因此我们稍微远离了共振。经验上，我们发现我们使用的染料分子（图1）在ω = ω0 − γ下操作可实现足够的透明度。

Kramers-Kronig关系式（方程1）和洛伦兹模型（方程2和3）预测，随着吸收分子的共振吸收波长增加，它们在提高介质的n′方面将变得更加有效。为了说明这一点，我们模拟了三个洛伦兹振子，它们的共振分别位于100、250和400 nm处（图2，B和C）。位于100 nm处的洛伦兹振子在n″上表现出弱吸收，导致可见光谱中n′的增加较小。相比之下，预测位于400 nm处的洛伦兹振子是一个更强的吸收体，具有更高的峰值n″，因此在更长波长处更有效地增加n′。这一理论预测通过实验得到了验证，如常见的OCA甘油在84 nm处的摩尔吸收系数α为0.012 M−1所示，对应于溶解在水中时可见光谱内每摩尔浓度溶解OCA诱导的介质n′变化的摩尔Δn′系数β（β的严格定义在材料和方法中提供，β的推导可在补充文本2中找到）为0.0129 M−1（图2，D和E，以及表1）。这一发现揭示了像甘油这样的传统OCA之所以能提高组织的折射率，是因为它们本身在短波长、极紫外（EUV）光谱（通常<150 nm）中就是吸收分子。然而，由于它们在极短波长处吸收（可能旨在在可见光谱中完全透明），传统OCA不是强吸收体，因此不善于提高介质的n′。例如，对于甘油的小β值0.0129 M−1，必须使用浓度为11.6 M（几乎纯甘油）的甘油来提高水的基线n′以匹配脂质的n′。这一要求深植于物理学之中，解释了为什么甘油作为OCA使用时必然导致组织脱水和收缩。

表1. 与传统OCA相比，吸收染料分子实现光学透明的效率。

这一理论预测也与酒石黄的α和β光谱一致（图2，F至I，表1及图S14），在其峰值吸收428 nm处具有高吸收系数(2.04 ± 0.02) × 104 M−1 cm−1（图2，D和E，以及图S1C），而在600 nm以上变得完全透明（图2J）。酒石黄在提高水的n′方面比甘油高效15倍以上（图2E），并且比其他常用OCA高出两到三个数量级（表1）。我们进一步通过绘制23个吸收分子的α和β与其从84到800 nm的峰值吸收对比图确认了RI增加对共振频率的依赖性，其中在较长波长处的强吸收和n′增加更为高效（图2，K和L，及表2）。这23个分子包括21个在可见光谱内吸收的分子，以及常用的OCA甘油和安替比林，后者在短波长紫外光谱中吸收。安替比林是在筛选了1600多种化学品后表现最佳的n′-匹配剂之一（24）；然而，它的β远低于可见光吸收分子，确认了洛伦兹振子模型所施加的可实现n′增加的波长依赖性。

表2. 本研究中使用的吸收染料分子。

<α>和<β>分别是在500到700 nm范围内平均的摩尔吸收系数和摩尔Δn′系数。

洛伦兹振子模型连同Kramers-Kronig关系一起预测，光学吸收分子可以带来比传统折射率匹配剂更实质和期望的光学性质变化。根据方程3和图2，K和L所揭示的依赖性，最有效的剂应该在成像波长上限界定的可能最长波长处具有其峰值吸收，以最大化n″和Δn′。同时，该剂应该具有单一狭窄的吸收峰，且在成像波长处没有任何额外的吸收。除了这些纯粹的光学要求外，这些剂还需要在水中显示出高溶解度和扩散性，以及出色的生物相容性，以便于体内应用。在采样了21个候选分子后（图2，M和N，表2及图S15），酒石黄脱颖而出，满足了可见光谱内实现光学透明度的所有要求（图2N）。具体来说，酒石黄在可见光谱的短极端附近有一个狭窄的吸收峰，并且其溶液在600 nm以上几乎不吸收（图2J和图S1）。此外，它在可见光谱中保持低α的同时展现出最高的β（图2M），如所有分子的β/α谱中最短波长处出现的“透明窗口”所示（图2N）。在使用酒石黄实现光学透明度后，能够检测到低至500 nm的发射，尽管在其共振峰428 nm附近吸收增加（图S16）。这一发现表明，酒石黄减少散射的效果超过了其吸收的增加，直至500 nm。

染料筛选还揭示了其他几项发现。首先，除了酒石黄外，还有14种染料在较长波长下实现组织透明度方面提供了相似甚至更大的潜力，其中Dye-21在近红外（NIR）光谱中显示出最大的潜力（图2，L和N）。其次，我们预测在NIR光谱中更容易实现体内光学透明度，这是由于共振吸收器在较长波长处获得的β值异常高。具体来说，Dye-21在800 nm处的β值高达>1.2 M−1（图2L），这比甘油和类似的OCA效率高出约100倍（表1），正如方程3中的洛伦兹振子模型所预测的。

最后，洛伦兹振子模型还为长期以来与实现体内组织透明度相关的挑战提供了理论基础。尽管最近在组织清晰化技术方面取得了进展（5），但大多数对离体组织有效，很少有适用于活体的（表3）（25, 26）。我们的理论框架基于洛伦兹振子模型和Kramers-Kronig关系，为这一挑战提供了洞见。传统的OCAs如甘油（27）、蔗糖（28, 29）和苄醇/苄酯（BABB）（30, 31）充当高折射率剂，弥合了内源性组织中水与其他高折射率成分（如脂质和蛋白质）之间的折射率差异。然而，我们的理论分析表明，这些分子的高折射率源于短波长、极紫外光谱中的吸收（图2）。方程3预测这些分子是弱洛伦兹振子，具有极小的β（表1）。这意味着它们在溶解时每单位浓度提高水的折射率效率低下。这一见解阐明了为什么这些OCA通常以非常高的浓度使用（例如，80%甘油（26）或80%果糖（29）），或者以其纯净形式使用（例如，纯甘油（27））。因此，传统的组织清晰化需要几乎完全用OCA替换原始的水含量，导致生物组织的大量脱水和收缩（2, 5）。这些要求使得这些传统的离体组织清晰化方法不适用于活体生物组织。