中农 | Microbiome：肠道菌群来源的肌苷通过添加膳食大麦叶激活PPARγ信号通路减轻肠炎
2021
07/12
微生态
https://www.cn-healthcare.com/articlewm/20210710/content-1241666.html
当前的研究中，我们证实了膳食中添加BL能够通过促进肠道动力和提高粘膜屏障功能预防DSS诱发的肠炎和菌群失调。
编译：微科盟向阳而生，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读 溃疡性肠炎是一种慢性肠炎，与肠道菌群失调和肠道生态平衡失调紧密相关。大麦叶（BL）在中医中的使用中有悠久的历史，它具有潜在的促进肠道健康的作用。但是，其作用机制目前尚不清楚。本篇文章中，我们研究了BL在肠道微生物代谢物调节过程和对肠炎预防方面潜在的作用并阐明了其潜在的分子机制。 通过16s rRNA基于基因的微生物学分析，我们首先发现日粮中添加BL可改善糖酐酯（DSS）引发的肠道菌群失调。BL预防DSS诱发肠炎的机制是通过激活过氧化物酶体增殖体激活受体（PPARγ）信号转导，提高肠粘膜屏障作用所引发的。不仅如此，代谢谱学分析表明肠道菌群通过调控结肠组织中BL-诱导的代谢重编程增强糖酵解过程而发挥作用。值得注意的是，膳食BL的添加引发了微生物来源嘌呤代谢产物肌苷的富集，该产物可激活人类结肠上皮细胞中PPARγ信号通路。此外，采用肌苷进行外源性处理可产生相似的保护效应，因为BL可通过提高腺苷2A受体（A2AR）/PPARγ依赖的粘膜屏障功能预防DSS诱发的肠炎。总之，我们的发现表明肠道菌群-肌苷-A2AR/PPARγ轴在维持肠道稳态中起到重要作用，并可通过对肠道菌群嘌呤代谢物的调控进而预防肠炎提供了新的治疗手段。 原名：Gut microbiota-derived inosine from dietary barley leaf supplementation attenuates colitis through PPARγ signaling activation
译名：肠道菌群来源的肌苷通过添加膳食大麦叶激活PPARγ信号通路减轻肠炎症状
期刊：Microbiome
IF：14.650
发表时间：2021.04
通讯作者：陈芳
通讯作者单位：中国农业大学食品科学和营养工程学院
本研究中，在DSS诱导的肠炎小鼠模型中对BL对肠道功能的有益影响进行研究，该模型是一种常用的肠炎模型，这种模型与人类溃疡性肠炎具有相似的特征。在本模型中，DSS处理后，上皮细胞屏障受到了化学性损伤，导致肠道微生物菌群平衡的扰动和功能的失调。如图1a所示，小鼠被给予标准饮食（CD）或者以2.5%比例添加BL等卡路里饮食（附件2；表S2）。在对照组和采用BL饲喂小鼠的采食量和水摄入量之间无显著差异（附件1：图S1A和B），表明BL对于小鼠的饮食习惯无副作用。在肠炎诱导过程中，添加BL显著的保护了DSS诱导的体重减轻，降低了疾病活性指数（DAI）评分，并导致了结肠长度缩短（图1b-d）；添加BL也显著的预防了DSS诱导的肠道的通透性（图1e）。由于炎性因子在肠炎发生过程中是关键因子，我们进一步评估了BL对炎性因子的影响。BL饲喂显著的增加了白介素（IL）-4和IL-10的水平，降低了DSS处理小鼠血清中TNF-α的水平（附件1：图S1C-E），相似的变化在结肠组织中也被观察到（附件1：图S1F-H）。这些数据表明BL有效的减轻了DSS处理小鼠中的肠炎症状。溃疡性肠炎与消化道菌群失调有关。为了研究BL是否能够预防DSS诱导的消化道菌群失调，我们通过对结肠组分中16S rRNA基因扩增子测序分析了消化道菌群的组成。基于UniFrac的主坐标分析（PcoA）显示CD + DSS组表现出细菌组成簇的偏移，与CD组或BL组都不同（PERM ANOVA，P < 0.001）（图1f），表明肠道菌群失调是由于DSS处理而导致的，而BL + DSS组小鼠的肠道菌群相比CD + DSS组的聚类结果更加接近CD和BL组，进一步证实了BL可对DSS引起的失调起到保护作用（PERMANOVA，P < 0.001）（图1f）。与之相一致的是，通过α多样性分析获得的Chao和Shannon指数分析结果表明BL显著降低了DSS诱导的细菌丰度和多样性的下降（图1g）。我们进一步在门和属水平上分析了消化道细菌的组成。BL显著的降低了DSS诱导的蛋白菌的丰度（Wilcoxon秩和检验， P < 0.01）（图1h）。同时，进一步的在属水平上的研究表明DSS处理可导致肠杆菌科细菌丰度的提高，这是一种常见的肠道菌群失调的标志，这种类型的失调也通过添加BL得到了有效的抑制（从20% ± 4%到1.5% ± 0.4%，Wilcoxon秩和检验， P < 0.0001）（图1i）。
（a-i）小鼠采用标准饲粮（CD）或等卡路里的添加BL日粮饲喂2周。肠炎通过服用溶解于饮用水中2.5% 的DSS7天进行诱导。（a）体内小鼠实验设计。（b）体重比例改变，（c）疾病活性评分，（d）结肠长度以及（e）消化道菌群组成在不同试验组小鼠OUT水平的主坐标分析作图（PCoA）（n = 10）。（g）不同试验组小鼠的消化道菌群丰度（Chao1指数）和多样性（Shannon指数）（n = 10）。（h）在门水平的消化道菌群组成和种属分布（n = 10）。为了评估预防性或者治疗性的设置是否可对预防DSS诱导的肠炎起作用，我们开展了另一项在DSS处理之前（beBL）或者过程中（duBL）的试验（附件1：图S1I）。相比duBL处理的小鼠，采用beBL处理的小鼠表现出体重丧失的增加，严重的DAI，以及结肠长度缩短的现象，产生的效果与BL组的效果相似（附件1：图S1J-L）；而对于结肠切片的组织学分析显示，CD + DSS和duBL + DSS组的小鼠表现出包括隐窝性状改变，杯状细胞丧失，以及炎症细胞渗透进入固有层和粘膜下层等严重损伤的情况在beBL+DSS和BL+DSS组中表显著减弱（附件1：图S1M和N）。总之，这些结果表明日粮中添加BL可预防DSS诱导的肠炎以及消化道菌群失调，这些结果可能很大程度上依赖于一些预防性手段。 我们推测添加BL后对于DSS诱导肠炎的预防效果可通过添加BL后改善肠道功能所解释。对肠道形态的研究表明饲喂BL的小鼠，其结肠的隐窝高度和肌肉层宽度与对照组小鼠相比显著提高（图2a-c）。然而，我们在小肠中未观察到形态学的变化（附件1：图S2A）。肌肉层的协同收缩辅助了肠道的运动。BL饲喂小鼠中结肠肌肉层宽度的增加促使我们推测饲喂BL是否对肠道运动产生影响，与对照组小鼠相比，我们观察到在BL饲喂的小鼠中排便次数的增加和肠道转运时间的缩短（图2d和e）。不仅如此，正如结肠粘膜表面明显的边角部位所示，扫描电镜图像显示出BL饲喂的小鼠表现出肠道超形态学的显著变化（图2f），表明BL可能通过提高肠道屏障功能对肠炎的预防起到辅助作用。但是，编码紧密连接的蛋白，比如闭合带1（ZO1）、封闭蛋白、紧密连接蛋白2、紧密连接蛋白4以及抗微生物多肽比如Reg3b、Reg3g、防御素4以及Mmp7（附件1：图S2B1）在饲喂BL的小鼠和对照组小鼠间的基因表达量无差异。另外，两组小鼠表现出相当的巨噬细胞数和嗜中性细胞渗入，这是由结肠组织中F4/80和Ly6G表达水平无明显差异所证实的（附件1：图S2J和K）。接着我们集中于对结肠肌肉层的研究，以更好的理解BL对粘膜屏障功能的影响。正如图2所示，阿尔新蓝染色显示：相比对照组小鼠，粘膜产生的杯状细胞数在BL饲喂的小鼠中表现出细胞凋亡数增加和粘膜表面该细胞分泌的增加，而BL饲喂组小鼠杯状细胞中的粘液素颗粒似乎出现在粘膜表面，这在对照组小鼠中是观察不到的（图2g）。粘液素2（Muc2）是形成粘膜层丰度最高的粘液蛋白，该蛋白高度糖基化并且由杯状细胞分泌。免疫组化分析表明：与对照组小鼠相比，饲喂BL小鼠的结肠中Muc2阳性的杯状细胞更多（图2h）。进一步通过透射电镜进行的研究表明，在BL饲喂小鼠中结肠杯状细胞膜包括了大量的粘液素颗粒（图2i），表明粘液素蛋白在结肠杯状细胞中生物学合成的增加和聚集，这些结果表明BL可能通过促进结肠运动能力以及增强粘膜屏障功能提高了肠道功能。3. BL改变了肠道基因表达谱并激活了PPARγ信号通路为了在BL饲喂小鼠中进一步阐明潜在的提高肠道动力和粘膜屏障功能的机制，我们采用转录组分析法对结肠组织进行RNA测序。在BL饲喂和对照组小鼠的转录组特征存在显著差异（图3a）。基于显著的FDR P值标准（倍数变化 > 1同时P < 0.05），我们鉴别出1735个发生显著变化的基因。与对照组相比，这些基因中，有912个基因在BL饲喂小鼠中上调，823个基因下调。我们对差异基因的KEGG通路分析发现一系列显著的富集通路（图3b），而PPAR信号通路在BL饲喂小鼠的功能性通路中富集最为显著（图3b）。在PPAR信号通路中26个具有显著变化的基因主要与营养代谢相关，比如脂类的生物学合成（Scd1），脂类降解（Lpl），脂类贮存（Plin1，Plin2，Plin4），脂类转运（Scp2，Slc27a1，Slc27a2），脂类结合（Fabp4，Fabp5，CD36，Ppara，Pparg），β氧化过程（Cpt1a，Acsl1，Acsl3，Ehhadh），以及胆固醇代谢（Hmgcs1，Hmgcs2，Cyp27a1）（图3c）。这与之前研究中所证实的脂类代谢与粘膜屏障功能紧密相关一致。我们进一步采用STRING分析描述发生显著变化基因的互作网络（图3d）；而采用qPCR，我们证实了PPAR通路中关键基因的mRNA表达，同时发现与对照组小鼠相比，Pparg在BL饲喂小鼠中发生了显著变化（图3e）。最终，BL饲喂小鼠结肠组织中PPARγ蛋白表达两点的上升进一步通过免疫组化得到证实（图3f）。总之，上述结果表明BL饲喂导致了与营养代谢相关基因的变化，并且PPARγ信号通路的激活可能影响了BL对于肠道的作用。PPARγ信号通路在肠道稳态调控中起到关键作用。为了评估PPARγ信号通路是否与肠道功能的改善相关，我们采用PPARγ信号转导拮抗物GW9662处理小鼠，处理方式为口服。与上述对于肠道形态的影响一致，BL饲喂导致了较高的隐窝高度和结肠中较宽的肌肉层（图4a-c）；不仅如此，排便频率的上升和肠道转运时间的缩短在BL饲喂的小鼠中也可以观察到（图4d和e）。但是，当PPARγ信号转导受到GW9662的抑制，BL对于肌肉层宽度、排便频率、肠道转运时间的效果就会消失（图4c-e）。PPARγ信号转导抑制也消除了BL在粘膜屏障功能中的作用，这是由于在GW9662处理小鼠中，BL不能增加产粘液杯状细胞的数量。确定PPARγ信号通路激活对于BL减轻肠炎的影响是必要的，我们在DSS诱导肠炎模型中研究了肠炎综合症。BL饲喂小鼠受到DSS诱导表现为体重减轻、DAI评分增加、肠道通透性增加、结肠缩短等（图4g-j）。但是，通过GW9662产生的PPARγ信号转导抑制消除了BL对DSS诱导性肠炎的保护作用（图4g-j）。另外，BL对于DSS诱导的上皮细胞损伤的保护效应也由于GW9662的处理而削弱（图4k和l）。总之，这些发现表明BL可能通过激活PPARγ信号转导通路预防DSS诱发的肠炎。
（a-i）饲喂2周标准饮食（CD）的小鼠或饲喂2周等卡路里添加BL的小鼠。（a）结肠切片HE染色的代表性图像。右侧框图但是左侧框图的放大。比例尺 = 200μm（左）以及100μm（右）。（b）隐窝高度和（c） CD-和BL-饲喂小鼠的肌肉层宽度进行定量分析（n =12）。（d）粪便颗粒以及（e） CD-和BL-饲喂小鼠的肠道转运时间被进行度量（n = 8）。（f）结肠粘膜表面扫描电镜的代表性图。比例尺 = 500μm。（g）阿尔新蓝染色的结肠组织切片的代表性图，其中对粘液产生的杯状细胞数量进行了定量分析（n = 12）。比例尺 = 100μm。（h） Muc2染色的结肠组织切片的代表性图，以及对Muc2阳性杯状细胞的数量进行定量（n =12）。比例尺 = 100μm，（i）结肠杯状细胞中粘液素颗粒（M）的透射电镜代表性图。比例尺 = 5μm。
（a-f）饲喂2周标准饮食（CD）的小鼠或饲喂2周等卡路里添加BL的小鼠（n = 3）。（a）小鼠结肠组织转录组谱学的主成分分析（PCA）。多变量方差重排分析（PERMANOVA）：F = 6.00，Df = 2，P = 0.017。（b）变化最为显著通路的KEGG通路富集分析。（c）PPAR信号转导通路中差异表达基因的热图。倍数变化 > 1以及FDR < 0.05的基因被认为是差异表达基因。（d）STRING网络可视化分析对PPAR信号转导通路差异表达基因的分析。（e）定量PCR对PPAR信号转导通路中差异基因的分析（n = 10）。f PPARγ信号转导通路（绿色）在小鼠结肠切片中的免疫荧光分析。细胞核采用DAPI（蓝色）进行染色。比例尺 = 100μm。
（a-l）饲喂2周标准饮食（CD）的小鼠或饲喂2周等卡路里添加BL的小鼠。PPARγ拮抗物GW9662采用灌胃法摄入，摄入量为3mg/kg/天。肠炎通过将2.5%的DSS溶解于饮用水中7天进行诱导。（a）HE结肠切片染色的代表性图。比例尺 = 100μm。（b）来自不同组小鼠结肠的隐窝高度以及（c）肌肉层宽度定量（n = 8）。（d）粪便排出量以及（e）不同组小鼠肠道转运时间（n = 8）。比例尺 = 200μm。（g）体重比例的变化。（h）疾病活性评分。（i）结肠长度，以及（j）不同组小鼠肠道通透性（n = 6）。（k）结肠组织切片的HE染色以及（l）组织学评分。比例尺 = 200μm。 膳食营养对于共生微生物的代谢产物具有很大的影响，这被认为是宿主-微生物互作的关键调控因子。我们假设BL影响肠道功能的潜在机制是通过微生物在肠道发酵过程中产生的次级代谢物。为了评估响应BL饲喂后的代谢变化，我们在结肠内容物和血清中通过代谢谱和高分辨率的气相色谱和质谱（GC-MS）进行分析。正如图5a和b所示，PLS-DA分析模型结果显示两个组具有显著的基因簇的差异。热图分析显示BL饲喂导致了代谢物显著的变化，其中共有23种代谢物（16种上调，7种下调）和28种代谢物（14种上调，14种下调）在小鼠结肠内容物和血清中分别表现出显著的变化（图5c和d）。代谢图显示出由BL饲喂影响的显著富集的通路，这些通路中的大多数与能量和营养代谢有关，比如葡萄糖、脂类和氨基酸代谢物（图5e和f）。值得注意的是，嘌呤代谢受到结肠内容物和血清中BL的显著影响（图5e和f），而我们发现肌苷和鸟苷，两种主要的影响嘌呤代谢的中间代谢物，是分别在结肠内容物和血清中响应BL饲喂的显著升高代谢物（图5c和d）。已知肌苷和鸟苷是在通过微生物发酵工业生产过程中获得的重要饲料添加剂。我们进一步推测肠道微生物可能与BL饲喂小鼠中肌苷和鸟苷的富集相关。为了检验该假设，我们采用广谱的抗生素处理BL饲喂小鼠和对照组小鼠以降低肠道微生物数量并通过靶标分析进一步检测了肌苷和鸟苷的水平。与对照组小鼠相比，BL饲喂小鼠的结肠内容物和血清中表现出显著上升的肌苷和鸟苷水平（图5g和h）。但是，抗生素处理显著的降低了上述两种嘌呤代谢物的水平（图5g和h）。基于肠道微生物在BL饲喂小鼠中调控肌苷和鸟苷过程中的作用，我们假设肠道微生物可能也在调控BL对于小鼠肠道功能方面发挥了重要作用。相应的，我们进行了非靶标的代谢物分析以研究两组结肠中差异表达的小分子代谢物。正如所期望的，PCA模型以及PLS-DA模型表现出两组间不同的代谢物聚集模型，暗示添加BL可导致结肠中代谢物的改变（附件1：图S3A）。热图分析表明45种代谢物在BL饲喂后发生显著的变化（附件1：图S3B）。其中，相比对照组，BL饲喂组中14种代谢物上升，31种代谢物下降（附件1：图S3B）。有趣的是，大多数存在差异的代谢物与能量代谢通路相关，而诸如葡萄糖，葡萄糖-6-磷酸以及果糖-6-磷酸显著下降，而乳酸显著上升（附件1：图S3C-F）。这与上述试验中得到的BL饲喂小鼠肠动力增加的结果一致（图2），表明BL可能通过增强糖酵解通路促进肠道动力。值得注意的是，当肠道菌群受到抗生素处理的抑制后，由BL导致的代谢变化就会消失（附件1：图S3C-F）。因此，上述数据表明BL通过肠道菌群依赖的方式诱导了结肠组织中的代谢重编程。为了直接评估肠道菌群在BL介导的嘌呤代谢物富集过程中的作用，我们在严格的厌氧条件下对新鲜的小鼠粪便进行孵育，并度量了肌苷和鸟苷的浓度（附件1：图S4A）。我们发现，通过微生物菌群对BL进行发酵导致了肌苷和鸟苷的显著上升，这在批量培养中未发生改变（附件1：图S4B和C）。为了阐明肌苷和鸟苷聚集的机制，我们采用16S rRNA基因测序通过批量培养，在12和24h分析了细菌的组成。正如12和24h BL发酵组相比其相应对照组所表现出的菌群簇差异所显示，BL发酵可导致菌群显著的变化（PERMANOVA，P < 0.05）（附件1：图S4D）。α多样性的下降在BL发酵组中的每一个时间点都可被观察到，表明BL发酵引发了特定细菌菌种的丢失（附件1：图S4E和F）。相比BL发酵组和批量对照组，在门水平分析菌群显示出硬壁菌门相对丰度的显著上升和拟杆菌相对丰度的下降（附件1：图S4G和H）。值得注意的是，BL将乳酸菌12小时发酵的相对丰度从0.41% ± 0.02%增加到25.89% ± 7.46%，24小时发酵的相对丰度从0.42% ± 0.15%增加到37.92% ± 2.92%（附件1：图S4I和J）。最终，Pearson相关分析显示乳酸菌的丰度与肌苷的浓度在厌氧培养的条件下呈现正相关（Pearson相关系数，R = 0.8883，P < 0.0001）；乳酸菌与鸟苷的浓度也呈现正相关（Pearson相关系数，R = 0.8883，P < 0.0001）（附件1：图S4K和L）。这些数据表明富集的乳酸菌可能与肌苷和鸟苷的富集相关，这与之前研究结果一致。5. 肌苷激活了人类结肠上皮细胞中PPARγ的信号转导通路 假设微生物代谢物与肠道上皮存在密切联系，我们假设代谢物对于肠道上皮细胞功能具有直接影响。为了研究上述效应，我们在体外评估了肌苷和鸟苷的功能活性。正如图6a和b所示，四种不同浓度的代谢物（分别添加0.5,1,2和4nM）对人类结肠上皮细胞HT-29的毒性无显著差异（图6a和b）。接着，我们采用基于荧光素酶系统检测肌苷和鸟苷对于PPARγ信号转导通路，而PPARγ荧光素酶活性在采用肌苷处理的细胞或在采用罗西格列酮处理的细胞中显著上升，但是在鸟苷处理的细胞中未表现出上升（图6c和d），表明肌苷而非鸟苷可能是BL介导的PPARγ信号激活通路的代谢产物。我们也观察到在PPARγ信号通路图表达量上升的关键基因，比如肌苷处理HT29细胞和另一种结肠上皮细胞系Caco2后，脂类降解基因CD36，Fabp4，脂类转运基因Slc27a1，以及β氧化基因Cpt1a的表达量显著上升（图6e和f）。PPARγ中升高的蛋白质水平进一步通过Western blot和免疫荧光成像进行证实（图6g-i）。为了研究PPARγ是否对于肌苷介导的粘液素蛋白的诱发是需要的，我们对PPARγ的表达采用siRNA进行抑制，发现Muc2的水平在肌苷处理后发生了显著的提高。但是，肌苷在PPARγ敲除的细胞中不能诱导Muc2（图6j和k）。由于肌苷是A2AR的受体，我们检测了肌苷是否通过A2AR介导的PPARγ信号转导通路被激活。正如图6l和m所示，肌苷在A2AR敲低细胞中不能诱导PPARγ和Muc2。这些结果表明肌苷至少通过A2AR/PPARγ通路诱导了粘液素蛋白的表达。6. 肌苷提高了肠道功能，并通过A2AR/PPARγ预防肠炎的发生我们进一步的确定了由肌苷诱导的A2AR/PPARγ的有益效果（图7a）。与上述体外数据一致，肌苷处理可导致PPARγ及其结肠组织中靶标基因表达量的显著上升（Lpl，Scd1，CD36以及Fabp4）（图7b和c）。同时，肌苷处理部分模拟了BL对于肠道形态学的效果，正如肌苷处理小鼠结肠肌肉层宽度显著增加所证实（图7d和e）。肌苷也通过增加排便频率增加了肠道动力并降低了肠道转运时间（图7f和g）。另外，我们的试验结果显示肌苷处理通过增加分泌粘液的杯状细胞数量提高粘膜屏障的功能（图7h）。但是，肌苷不能在GW9662或A2AR特异拮抗物SCH58261处理的小鼠中引发该效应（图7e-h）。我们接着研究了肌苷是否对BL预防DSS诱导肠炎起作用。正如图7i-k所示，肌苷降低了DSS引发的体重减轻，降低了DAI评分，并引发了结肠缩短。我们也观察到肌苷有效的增强了屏障功能，这是由DSS处理小鼠的肠道通透性和组织学损伤提高所证实（图7l-n）。不仅如此，当小鼠采用GW9662或者SCH58261处理后肌苷对于肠炎的有益效果发生逆转（图7i-n）。我们的数据表明肌苷部分的通过A2AR/PPARγ信号转导通路引发对肠道的保护作用。
图5 BL改变了代谢谱并富集了菌群来源的嘌呤代谢物（a-h）饲喂2周标准饮食（CD）的小鼠或饲喂2周等卡路里添加BL的小鼠。（a, b）CD和BL饲喂小鼠的结肠内容物（n = 5）和血清（n = 6）的PLS-DA代谢谱。（c, d）结肠内容物（n = 5）和血清（n = 6）中发生显著变化的代谢物的热图。PLS-DA模型中VIP > 1以及Student t检验值 < 0.05被认为具有显著差异。（e, f）CD和BL饲喂小鼠结肠内容物和血清中发生显著改变的代谢物通路富集分析。X轴代表通路的影响，y轴代表通路富集。（g，h）CD和BL饲喂小鼠（n = 8）结肠内容物和血清中肌苷和鸟苷的浓度。AB，抗生素。
图6 肌苷激活了PPARγ在人类结肠上皮细胞中的信号转导通路
（a, b） HT29细胞采用肌苷（0.5,1,2和4mM）或鸟苷（0.5,1,2和4mM）处理24h，细胞活性分析采用CCK-8分析进行度量。（c, d）HT29细胞采用不同浓度肌苷（0.5,1,2和4mM）和鸟苷（0.5,1,2和4mM）或10μM罗西格列酮（Rosi）处理24h，PPARγ的活性通过荧光素酶报告基因分析进行度量。（e, f）HT29和Caco2细胞采用肌苷进行处理（2和4mM）24h，通过荧光定量PCR分析检测PPARγ信号通路中表达的基因。（g, h）HT29和Caco2细胞采用肌苷进行处理（2和4mM）24h，PPARγ信号通路中的蛋白质水平采用Western blot进行检测。（i）HT29和Caco2细胞采用肌苷处理（2和4mM）24h，PPARγ信号通路中的蛋白质水平（绿色）采用免疫荧光进行检测。细胞核采用DAPI（蓝色）进行染色。比例尺 = 20μm。（j, k）HT29和Caco2细胞采用肌苷进行处理（2和4mM）24小时，采用siRNA敲低PPARγ信号通路中的基因表达。PPARγ信号通路和Muc2中的蛋白质水平采用Western blot进行检测。（l, m）HT29和Caco2细胞采用肌苷进行处理（2和4mM）24h后A2AR采用siRNA进行敲低。A2AR，PPARγ，Muc2的蛋白质表达水平采用Western blot进行分析。Sc siRNA转染被用于对照。免疫印迹采用ImageJ软件进行定量分析（a-f）。
图7 肌苷通过A2AR/PPARγ信号通路预防DSS诱导的肠炎
（a-n）将800mg/kg/d的肌苷溶解于PBS中，制成终浓度为40mg/ml的溶液，采用灌胃法给小鼠灌服。PPARγ拮抗物GW9662以3mg/kg/d的浓度进行灌服，同时A2AR拮抗物SCH58261以2mg/kg/d的浓度进行腹腔内注射。肠炎通过灌服2.5%DSS溶解于饮用水中7天进行诱导。（a）体内小鼠实验的试验设计。（b）不同组小鼠的PPARγ（绿色）在小鼠结肠切片中的免疫荧光分析。细胞核采用DAPI进行染色（蓝色）。比例尺 = 100μm。（c）通过荧光定量PCR分析PPAR信号转导通路（n = 8）中的差异表达基因。（d）对不同组小鼠的隐窝高度以及（e）肌肉层宽度进行定量（n =12）。（f）对排出的粪便颗粒以及（g）不同组小鼠转运时间进行度量（n = 12）。（h）不同组小鼠的代表性阿尔新蓝染色和Muc2染色的结肠切片。对粘液产生的杯状细胞数量和Muc2阳性杯状细胞进行定量（n = 12）。比例尺 = 100μm。（i）体重比例的变化，（j）疾病活性评分。（k）结肠长度，以及（l）肠道通透性在不同组的小鼠中进行度量（n = 8）。（m）HE染色结肠组织切片的代表性图。（n）组织学评分。比例尺 = 100μm。溃疡性结肠炎已成为世界范围内的健康威胁。传统的基于药物的疗法导致了可观的经济损失和一些副作用。因此，开发有效且安全的治疗药物的需求仍然紧迫。BL，一种中药中草本膳食添加剂，由于其对于肠道功能潜在的有益效果，成为一种具有潜力的候选药物。本研究中，我们发现膳食中添加BL可预防DSS诱导的肠炎和肠道菌群失调。不仅如此，我们首次发现肌苷，一种肠道菌群的嘌呤代谢物，通过提高A2AR/PPARγ依赖的粘膜屏障功能，可预防DSS诱发的肠炎（附件1：图S5）。因此，我们的研究结果表明微生物菌群-肌苷-A2AR/PPARγ轴对于预防和治疗肠道炎症具有巨大的潜力。肠道聚集了多种多样的微生物群落，在维持肠道稳态方面发挥了关键的作用。大量证据表明肠道菌群失调与溃疡性肠炎的病理过程有关。例如，与健康人相比，患肠炎的病人表现出肠道菌群多样性下降的情况。与这些发现一致，我们的16S rRNA基因测序数据也表明DSS处理可导致小鼠肠道微生物菌群种类和多样性的下降，该下降通过添加BL得到有效的恢复。与失调相关的肠道菌群多样性下降可能是由于共生菌和具有潜在病理作用的微生物平衡偏移。事实上，有报道称健康的肠道菌群组成主要由厌氧型的硬壁菌和拟杆菌组成，而菌群失调的特征是肠杆菌科家族厌氧性病原菌的扩增。在当前的研究中，我们发现BL显著的抑制了DSS处理小鼠肠杆菌丰度的提高。BL抑制DSS诱导的肠道菌群失调的机制可能部分归结为其激活结肠中PPARγ信号通路有关，由于最近的研究报道了PPARγ的激活能够通过在结肠上皮细胞中促使β氧化过程限制肠道的含氧水平，因此抑制了病原性肠杆菌的扩增。除肠道菌群外，其它一些关键因素也影响了肠道稳态的维持，包括肠道活性和屏障，这是由于肠道活性和粘膜屏障的失调在患肠炎的病人中是常见的症状。本研究中，我们发现BL预防DSS诱发的肠炎是通过一些预防性措施，这些措施大多由于其对肠道功能的有益效果。BL处理小鼠隐窝高度的增加和肌肉层宽度的增加表明膳食中添加BL可诱发肠道动力的增强，从而预防肠炎的发生，这也通过排便频率的增加和肠道转运时间的缩短得到证实。值得注意的是，BL诱导的形态学变化对于微生物种类多样的大肠是特异性的，这可能可以部分解释肠道动力的增强，而厌氧处理BL饲喂小鼠代谢的变化，表明BL可能可以通过肠道微生物依赖的方式促进肠动力。我们随后将RNA测序用于研究BL对于肠道功能的潜在机制方面。BL处理后，与生物合成、降解、贮存、转运、以及结合脂类相关基因的表达水平发生了显著的提高。之前的研究显示脂肪酸合成酶在维持肠道屏障功能方面的的必要作用。因此，与脂类代谢相关的基因表达量的增加可能能够解释BL饲喂小鼠粘膜屏障功能的提高。进一步的功能性分析显示PPAR信号转导通路是响应BL饲喂过程中富集程度最为显著的功能性通路。PPARγ是主要在脂肪组织中表达的关键核受体，并且通过对一系列调控脂类代谢的基因调控对胰岛素的抗性。PPARγ也在结肠中高表达，其表达在患溃疡性结肠炎的病人中被破坏。PPARγ信号通路调控肠道稳态的机制被报道与调控结肠上皮细胞分化，适应性免疫效应因子T细胞的功能，以及先天性免疫过程中抗菌响应相关。不仅如此，PPARγ信号通路在调控小肠粘膜免疫防御过程中高脂饮食的影响也发挥了重要作用。假定PPARγ在调控肠道稳态方面发挥了关键性作用，PPARγ被认为是治疗肠炎重要的靶标。例如，曲格列酮和罗西格列酮是两种PPARγ合成配体，在试验性肠炎模型和患溃疡性肠炎的病人中可显著的降低疾病的严重性。除此之外，PPARγ也是5-氨基水杨酸（一种最古老的用于治疗肠炎的抗炎性制剂）的重要靶标。有趣的是，很多存在于食物中的天然配体比如共轭亚油酸被报道可通过PPARγ信号激活有效地预防肠炎的发生。值得注意的是，共轭亚油酸是一种能够通过肠道乳酸杆菌产生的代谢物，表明肠道菌群在调控PPARγ信号转导过程中也进行了参与。相应的，另一项研究证实了微生物发酵产物丁酸盐可诱导PPARγ体内和体外的信号激活过程。为了寻找BL介导的PPARγ信号激活的潜在拮抗物，我们进行了一种非靶标性的代谢组学分析。我们发现添加BL可导致嘌呤核苷酸、肌苷以及鸟苷在结肠内容物和血清中的富集。我们通过采用体外功能分析研究了其活性。结果表明PPARγ的活性和表达可通过肌苷处理在人类结肠上皮细胞中引发，暗示肌苷可能是PPARγ信号激活过程中的潜在拮抗物。进一步的，外源性肌苷的处理可激活结肠PPARγ信号通路并通过提高粘膜屏障功能预防DSS诱发的肠炎。值得注意的是，在体内和体外试验中未出现无明显的毒副作用，表明肌苷可被开发为一种治疗肠炎的有前景的制剂。然而，进一步的研究需要确定肌苷在治疗溃疡性肠炎过程中的效果和安全性。已知肌苷和鸟苷都是重要的饲料添加剂，与谷氨酸钠一起可协同发挥“提鲜”作用。在工业生产层面，微生物发酵技术是生产上述鲜味剂的重要手段。通过采用基因工程方法，一些菌株比如枯草芽孢杆菌、氨根棒状杆菌以及大肠杆菌被用于增加这些嘌呤核苷酸的产量。应注意到肌苷和鸟苷的生产也可通过棉囊阿舒氏酵母经代谢工程的方法获得，表明真核和原核微生物在工业化核苷酸生产过程中的潜在用途。在当前的研究中，厌氧处理和厌氧发酵试验证实了肠道菌群在促进嘌呤代谢物富集方面不可或缺的作用，这也与最近发表的研究结果一致。有趣的是，16S rRNA基因测序获得的细菌组成显示乳酸菌在BL发酵过程中丰度的增加，表明乳酸菌在调节上述嘌呤代谢物过程中的富集。最近的一项研究证实罗伊氏乳杆菌能够通过肌苷-A2AR信号转导抑制T细胞缺乏诱发的自体免疫过程所支持。当前的研究中，通过拮抗配体SCH58261抑制A2AR阻断了肌苷对于PPARγ信号通路激活和粘膜屏障功能提升的效应，表明A2AR可能是治疗肠道疾病的新靶标。当前的研究中，我们证实了膳食中添加BL能够通过促进肠道动力和提高粘膜屏障功能预防DSS诱发的肠炎和菌群失调。另外，BL可促进微生物来源的嘌呤代谢物肌苷的富集，并诱发A2AR/PPARγ信号激活，同时作用于BL提升肠道功能。我们的结果强调了BL和肌苷可被用于患肠道功能失调病人的有效膳食添加物。
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关键词:
肠道菌群大麦叶代谢物肌苷肠炎膳食
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